Новые белки из старого конструктора

Большинство белковых молекул состоит из нескольких функциональных блоков (доменов). Например, белки, участвующие в передаче сигналов, часто содержат домены двух типов — регуляторные и каталитические. Первые реагируют на поступающие сигналы и определяют условия, при которых белок-передатчик «сработает». Вторые передают сигнал следующему участнику каскада (например, присоединяют фосфатную группу к другому белку, переводя его в активное состояние). Каждый такой белок действует как оператор условного перехода «если… то», причем регуляторный домен отвечает за «если», а каталитический — за «то».

Ученые давно предполагали, что перетасовка фрагментов белковых молекул может быть важным источником эволюционных новшеств ( Ратнер, 1993 ). На это указывают данные сравнительной генетики, а недавно начали появляться и прямые экспериментальные подтверждения. Одно из них получили биологи из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, взявшись изучать сигнальный каскад, регулирующий половое поведение дрожжей ( Peisajovich et al., 2010 ).

Дрожжи, как уже говорилось в главе 3, делятся на два «пола»: а и α. Эксперименты проводились с полом а. Сигналом к спариванию для этих клеток служит альфа-фактор — феромон, выделяемый полом α (см. рисунок). Феромон взаимодействует с рецептором Ste2, который находится на поверхности клетки а. В результате комплекс из трех белков, прикрепленный к рецептору с внутренней стороны мембраны, распадается. Освободившийся белок Ste4 взаимодействует с белком Ste5, в результате чего Ste5 с прикрепленными к нему протеинкиназами [75]Ste11, Ste7 и Fus3 транспортируется к клеточной мембране. Здесь благодаря посредничеству белка Ste50 устанавливается связь между Ste11 и Cdc42. Последний белок входит в состав комплекса из трех белков, один из которых — киназа Ste20 — активирует белок Ste11, прикрепляя к нему фосфатную группу. Ste11 в свою очередь фосфорилирует киназу Ste7, а она активирует киназу Fus3. Активированный белок Fus3 отправляется в ядро, где он активирует несколько транскрипционных факторов, которые в свою очередь включают комплекс генов, необходимых для спаривания. В клетке приостанавливаются процессы, связанные с ростом и делением, меняется морфология клетки, и кончается все тем, что клетка а сливается со своим половым партнером — клеткой α.

Эксперименты проводились с 11 белками, которые на рисунке обозначены серыми овалами. Шесть из них состоят более чем из одного домена. Гены многодоменных белков разрезали на части, а фрагменты перекомбинировались случайным образом. В итоге были получены гены 66 новых белков. Эти гены затем поодиночке вставляли в дрожжевые клетки. При этом исходный сигнальный каскад оставляли без изменений, лишь добавляя к нему новых потенциальных участников. Все искусственные гены были соединены с одним и тем же регуляторным участком (промотором), что обеспечивало одинаковый (невысокий) уровень активности внедренных генов.

Схема сигнального каскада, запускающего программу «брачного поведения» у дрожжей. Из Peisajovich et al., 2010 .

Чтобы оценить эффективность работы сигнального каскада у 66 генно-модифицированных штаммов дрожжей, в их геномы был добавлен ген зеленого флуоресцирующего белка, соединенный с промотором, который реагирует на один из транскрипционных факторов, активируемых белком Fus3. В результате по силе свечения можно было определить силу реакции сигнального каскада на добавление в среду альфа-фактора. Регистрировались два параметра: «базовая» сила свечения, которая наблюдается до добавления альфа-фактора, и скорость, с которой свечение усиливается после добавления феромона.

Оказалось, что в десяти случаях из 66 добавление нового белка изменило поведение сигнального каскада. У одних штаммов изменился базовый уровень активности, у других — интенсивность реакции на феромон.

Но эти изменения теоретически могли быть вызваны не перекомбинированием доменов в добавленном белке, а просто тем, что какого-то домена в клетке стало больше. Чтобы исключить эту возможность, провели контрольные эксперименты. В клетки вставляли дополнительные копии целых генов и их усеченных, но работающих вариантов (кодирующих только один из доменов многодоменного белка). Эти манипуляции, однако, не повлияли на работу сигнального каскада. Значит, полученные в эксперименте новые признаки связаны именно с новыми свойствами белков, образованных путем перекомбинирования доменов.

Приводит ли более интенсивная работа сигнального каскада к реальному повышению половой активности? Чтобы это выяснить, исследователи смешивали модифицированные дрожжи с дикими дрожжами другого пола (альфа) и подсчитывали число успешных слияний. Оказалось, что те клетки, у которых скорость реагирования каскада на феромон увеличилась, действительно спариваются чаще, чем контрольные, и наоборот — те клетки, у которых чувствительность каскада снизилась, спариваются реже.

Рекордсменами оказались дрожжи с искусственным белком, состоящим из половинок Ste50 и Ste7, и с другим химерным белком, собранным из фрагментов Ste5 и Ste11. Эти «половые гиганты» спаривались втрое чаще, чем контрольные исходные дрожжи.

Для некоторых случаев удалось расшифровать молекулярные механизмы возникших изменений. Например, белок, собранный из регуляторного домена Ste5 и каталитического домена Ste11, создал новый «обходной» путь передачи сигнала от рецептора Ste2 к Fus3. Это заставляет клетку интенсивнее реагировать на феромон, что повышает вероятность спаривания.

Может ли повышение половой активности дрожжей, наблюдавшееся в эксперименте, быть полезным? Будет ли оно поддержано отбором, если такая мутация возникнет в природной популяции? Судя по тому, что мы знаем о действии отбора на склонность к сексу (см. главу 3), это возможно, особенно в неблагоприятных и переменчивых условиях. В эксперименте повышение половой активности ничуть не повредило здоровью подопытных клеток.

Такие исследования показывают, что перекомбинирование доменов может быть важным источником эволюционных новшеств — наряду с другими «крупномасштабными» мутациями, такими как дупликация генов и появление новых регуляторных участков ДНК. Важно, что перекомбинирование может приводить к мгновенному появлению новых признаков, тогда как дупликация генов создает новшества не сразу, а лишь после того, как две копии гена хоть немного «разойдутся» по своим функциям, накопив нуклеотидные замены.

—————