Определение ферментативной активности

В солоде определяют активность амилолитических, декстринолитических и осахаривающих ферментов.

Колориметрический метод определения амилолитйческой (декстриногенной) активности (метод ВНИИФСа)

Амилолитическую (или декстриногенную) активность определяют по скорости ферментативного гидролиза крахмала, которую устанавливают по количеству крахмала, превращенного в процессе этой реакции. Декстриногенная активность характеризует способность ферментов солода катализировать расщепление 1 г крахмала в основном на декстрины с очень небольшим образованием сахаров, Эта активность в основном обусловлена присутствием, а-амилазы.

Активность солода характеризуется числом единиц, амилолитической активности (АС), содержащихся в 1 г или 100 мл исследуемого материала. За единицу амилолитической активности принимают такое количество фермента, которое катализирует гидролиз 1 г растворимого крахмала в строго определенных стандартных условиях (температура реакции 30° С; рН раствора 4,7—4,9; продолжительность 60 мин; постоянное соотношение фермент — субстрата в реакционной среде, обеспечивающее гидролиз крахмала на 30% за 10 мин).

В основу определения амилолитической активности , полупродуктов спиртового производства положена зави­симость степени гидролиза крахмала от числа единиц фермента, взятого на анализ для проведения фермента­тивной реакции.

Степень гидролиза крахмала определяют колоримет­рические йодометрическим методом.

Активность ферментного материала подсчитывают по уравнению, составленному на основе изучения зави­симости степени гидролиза крахмала от количества фер­ментного материала, взятого на реакцию.

Ход определения. Приготовление фермент­ного раствора. Для определения амилолитической активности отбирают среднюю пробу солода, измельчают и определяют влажность.

Одновременно берут навеску солода 5 г для проведения ферментативной реакции, помещают ее в стакан, заливают 10 мл фосфатного буфера с рН 4,7—4,9 и 90 мл дистиллированной воды. Полученную смесь для полного извлечения ферментов выдерживают в термостате при 30° С в течение часа, периодически перемешивая ее стеклянной палочкой. Затем смесь фильтруют, и фильтрат используют в качестве основного раствора для определения амилолитической активности солода.

Для проведения ферментативной реакции используют рабочий раствор, который готовят из основного путем разбавления (табл. 2).

Таблица 2. Приготовление рабочих растворов

Проведение ферментативного гидроли­за крахмала. Реакцию проводят в строго определен­ных, стандартных условиях с использова­нием фосфатного, буфера, продолжительность 10 мин; объем реакционной среды 15 мл (10 мл субстрата и 5 мл ферментного раствора).

Для анализа берут две пробирки высотой 180 мм и диаметром 18 мм, наливают в каждую по 10 мл субстра­та и ставят в ультратермостат. Пользоваться воздуш­ным термостатом не рекомендуется. Предпочтительно пользоваться ультратермостатом (или водяной баней) с постоянной температурой 30±0,2°С. В термостате про­бирки выдерживают 5—10 мин, чтобы растворы приняли необходимую температуру, затем, не вынимая пробирок из термостата, наливают в первую из них 5 мл дистилли­рованной воды (контрольная проба), а во вторую — 5 мл рабочего раствора фермента (испытуемая проба). Смеси быстро перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 10 мин, после чего вынимают пробирки из термостата и отбирают от контрольного и испытуемого растворов по 0,5 мл, переносят их в одну из колбочек с предварительно налитыми туда 50 мл ра­бочего раствора йода в 0,1 н. растворе соляной кислоты и взбалтывают. В растворах под действием соляной кислоты происходит инактивация ферментов — действие их прекращается. Продукты реакции вступают во вза­имодействие с йодом, и растворы окрашиваются: первый (из контрольной пробы) — в синий цвет, второй (из опытной пробы)— в фиолетово-коричневый различной ин­тенсивности в зависимости от количества прогидролизованного крахмала.

Непосредственно после смешивания растворов про­водят определение их оптической плотности на фотоэлектроколориметре ФЭК-Н-60 или другой марки, в кюве­тах с длиной грани 1 см при красном светофильтре (λ—656 нм). Колориметрирование проводят по инструк­ции, прилагаемой к прибору, снимая показания по крас­ной шкале левого барабана.

Оптическая плотность контрольного раствора показы­вает количество исходного крахмала в субстрате. Опти­ческая плотность опытного раствора соответствует коли­честву «крахмала», оставшегося непрогидролизованным после действия фермента. Этот крахмал следует пони­мать условно, так как фактически в растворе крахмала нет, он превратился в декстрины, которые и дают фио­летово-коричневую окраску. Разница оптических плот­ностей обоих растворов соответствует тому количеству крахмала, которое подверглось гидролизу под действием ферментов исследуемого материала.

Содержание прогидролизованного крахмала опреде­ляют по формуле

C=

где D₁ и D₂ — оптические плотности соответственно контрольного и опытного растворов; 0,1 — количество крахмала, взятое на анализ, г.

Если окажется, что количество прогидролизованного крахмала меньше 0,020 или больше 0,075 г, то анализ повторяют. Готовят рабочий раствор с большим или меньшим количеством основного раствора.

Если в результате ферментативной реакции количест­во превращенного крахмала находится в указанных пре­делах, полученные данные используют для определения амилолитической активности по специальному уравне­нию, подставляя в него найденную величину. Вследствие специфичности комплекса ферментов солодов определе­ние их активности проводится по специальным уравне­ниям, характерным и применимым только для анализа этого рода ферментов.

Уравнение для расчета амилолитической активности солода имеет вид:

АС=

где С — количество превращенного крахмала, г;

6,889 и 0,029388 — коэффициенты, полученные при математической обработке экспериментальных данных изучения зависимости количества прогидролизованного крахмала от количества фер­мента, взятого на анализ (в коэффициенты введен пересчет на 60 мин действия фермен­та);

п — масса солода в реакционной среде, мг.

Пример.Для анализа взят ячменный солод. Приготовлен основ­ной раствор: 5 г солода в 100 мл дистиллированной воды с фос­фатным буфером. Солод предположительно обладает высокой ак­тивностью—порядка 30 ед/г. По табл. 13 находим количество основного раствора солода, необходимое для приготовления рабо­чего. Оно равно 4 мл/100 мл.

Тогда в 5 мл рабочего раствора солода будет содержаться 10 мг (n=10).

При колориметрировании получены следующие значения опти­ческих плотностей: D₁=0,725, D₂=0,388.

Количество прогидролизо­ванного крахмала:

C= =0,04648 г

Подставляя значения С и п в уравнение определяем АС исследуемого солода:

АС= =29,08 ед/г

или АС в пересчете на абсолютно сухое вещество при влажности солода 38%

=46,9 ед/г

Химический метод определения декстринолитической активности (ДС) (метод ВНИИСПа)

Декстринолитическая активность характеризуется способностью ферментов катализировать гидролиз ко­нечных декстринов (фосфодекстринов) со связью 1—6. Солод и культуры плесневых грибов характеризуются количеством единиц декстринолитической активности (ДС), содержащихся в 1 г или в 100 мл исследуемого материала. За единицу декстринолитической активности принимается такое количество фермента, которое ката­лизирует гидролиз 1 г конечных декстринов до редуци­рующих сахаров за 1 ч в строго стандартных условиях (температура реакции 30°С; продолжительность 60 мин; рН среды 4,7—4,9; концентрация, субстрата 1%; объем реакционной среды 15 мл; объем субстрата 10 мл; по­стоянное соотношение фермент — субстрат в реакцион­ной жидкости, обеспечивающее гидролиз декстринов на 30% за 60 мин).

В основу определения декстринолитической активно­сти ферментных материалов положена зависимость ко­личества сахара, образовавшегося в процессе фермент­ной реакции, от числа единиц фермента, взятого на анализ.

Количество сахара, образовавшегося в процессе фер­ментной реакции, определяют йодометрическим мето­дом. Количество взятого на анализ фермента устанав­ливают по графику (или соответствующему ему расчет­ному уравнению), где по оси абсцисс откладывается число единиц фермента, взятое на анализ, а по оси ор­динат— количество сахара, образовавшегося в процес­се ферментативной реакции.

Относя полученную величину к 1 г или 1 мл иссле­дуемого ферментного материала, определяют его декстринолитическую активность в условных единицах (ДС).

Ход определения.Приготовление исследуе­мого ферментного раствора солода. Берут 5 г солода (ячменного, просяного или овсяного) из рас­чета на абсолютно сухое вещество, растирают в ступке с кварцевым песком или измельченным стеклом, при­бавляют 5 мл фосфатного буферного раствора с рН 4,85 и 45 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и выдерживают в термостате 30 мин при 30° С, затем раствор фильтруют и фильтрат используют для анализа.

Приготовление реактивов для проведения анализа описано в приложении.

Проведение ферментативной реакции. В две пробирки (длиной 180 мм и диаметром 18 мм) вводят пипеткой точно по 10 мл 1%-ного раствора суб­страта. Пробирки с субстратом помещают на 10 мин в термостат с температурой 30° С, чтобы субстрат приоб­рел эту температуру. Затем в пробирки с субстратом вводят по 5 мл ферментного раствора, перемешивают и выдерживают реакционную смесь в термостате в тече­ние часа при 30° С для проведения ферментной ре­акции.

По истечении этого времени реакцию приостанавли­вают добавлением в реакционную смесь 1 мл 1 н. ра­створа соляной кислоты. Затем в растворе определяют количество образовавшегося сахара. Для этого содер­жимое пробирок количественно переносят в коническую колбу на 300 мл, пробирки ополаскивают водой, про­мывные воды приливают в колбу с реакционной смесью и добавляют 20 мл 0,1 н. раствора йода и сразу же по каплям при перемешивании приливают 60 мл 0,1 н. ра­створа едкого натра или кали. Колбу накрывают часо­вым стеклом и оставляют стоять в течение 15 мин. За­тем в раствор вводят 2 мл разбавленной серной кислоты (1:4) и оттитровывают избыток йода 0,1. н. раство­ром гипосульфита. Одновременно ставят контрольный опыт, необходимый для определения содержания саха­ров в самом субстрате. Для проведения контрольного опыта в колбочку на 300, мл вводят 10 мл субстрата, 1 мл 1 н. раствора соляной кислоты, 5 мл ферментной вытяжки. Добавляют воды до 100 мл и проводят опре­деление сахара таким же образом, как и в основном опыте. Количество образовавшегося сахара определяют по разности между объемом гипосульфита, пошедшим на титрование контрольной и исследуемой проб. Эта разность должна быть в пределах 1—6 мл. Если она боль­ше 6 мл или меньше 1 мл, то анализ повторяют, соот­ветственно уменьшая или увеличивая навеску исследуе­мого продукта.

Если разность между контрольным и исследуемым опытами находится в указанных пределах, полученные данные используют для определения декстринолитической активности.

Для расчета декстринолитической активности берут среднее значение объема гипосульфита, пошедшего на титрование двух параллельных проб. Для определения сахара, образовавшегося в процессе реакции, получен­ную разность умножают на 17,1 мг, так как 1 мл 0,1 н. раствора йода или 1 мл 0,1 н. раствора гипосульфита эквивалентны 17,1 мг мальтозы.

Декстринолитическая активность определяется по расчетному уравнению, которое составлено на основе экспериментально выявленной зависимости между образовавшимся сахаром и количеством фермента в исследуемом материале, взятом для анализа.

Уравнение для расчета ДС солодов имеет вид (в ед,/г):

ДС= ед/г

где 1,240; 7,5 — коэффициенты, определенные экспериментальным путем;

b— разность в объеме гипосульфита при основном и контрольном титровании;

17,1 - количество мальтозы, эквивалентное 1 мл 0,1 н. раствора йода или 1 мл 0,1 н. раствора гипосуль­фита, мг;

а — количество исследуемого солода в вытяжке, взя­той на анализ, г.

Пример.Взята навеска солода 5 г. На анализ взято 5 мл фер­ментной вытяжки. В ней содержится 0,5 г солода. Следовательно, а = 0,5. На титрование исследуемой пробы пошло 13,35 мл 0,1 н. раствора гипосульфита. На титрование контрольной пробы — 15,35 мл. Разность, в количестве раствора гипосульфита, пошед­шего на титрование контрольной и исследуемой проб, b= 15,35- 13,35 = 2 мл.

Декстринолитическая активность солода будет равна

ДС= =65,58x10^;3 ед/г

Колориметрический метод определения осахаривающей активности ОС (метод ВНИИПрБ)

Осахаривающая активность характеризует способ­ность ферментов катализировать гидролиз крахмала до сахаров.

Активность солода и культур плесневых грибов ха­рактеризуется числом единиц осахаривающей актив­ности ОС, содержащихся в 1 г исследуемого материала. В основу определения осахаривающей активности поло­жена зависимость количества крахмала, превращающе­гося в сахара в процессе ферментативного гидролиза, от числа единиц активности фермента, взятого на анализ.

Количество взятых на определение единиц фермента узнают по выведенному графику (или соответствующе­му ему уравнению), где по оси ординат отложена опти­ческая плотность, пропорциональная количеству обра­зовавшегося сахара, а по оси абсцисс — число единиц фермента. Относя полученную величину к 1 г исследуе­мого ферментного материала, определяют его актив­ность в условных единицах.

За единицу осахаривающей активности (ОС) прини­мается такое количество фермента, которое катализи­рует гидролиз 1 г растворимого крахмала до спирторастворимых сахаров, определяемых в ед. глюкозы, в строго определенных стандартных условиях (темпера­тура реакции 30° С; рН раствора 4,85 и время 10 мин; постоянное соотношение фермент — субстрат в реакционной жидкости, обеспечивающее превращение крах­мала за 10 мин в глюкозу на 10%).

Для определения осахаривающей активности исполь­зуют ту же реакционную среду, в которой определяют амилолитическую активность. Устанавли­вают в ней содержание спирторастворимых сахаров (в ед. глюкозы), образовавшихся в процессе фермента­тивной реакции, которое определяют в фильтрате после осаждения высокомолекулярных углеводов спиртом, с применением антронового колориметрического метода.

Для определения берут 3 мл реакционной жидкости в мерную колбу на 25 мл, добавляют для осаждения непрогидролизованного крахмала и декстринов 22 мл спирта-ректификата (96% об.), осадок отфильтровы­вают, от фильтрата отбирают 25 мл и разбавляют его водой в 2 раза. В разбавленном фильтрате непосред­ственно определяют сахар. Для этого берут 5 мл антронового реактива, помещают его в пробирку из тугоплавкого стекла с притертой пробкой и осторожно по стенке пробирки доливают к реактиву 2,5 мл разбавленного спиртового фильтрата с таким расчетом, чтобы жидкости не смеши­вались, а образовали два слоя, после чего пробирки закрывают притертой пробкой.

Параллельно готовят холостую пробу путем добавления таким же способом к 5 мл реактивов 25 мл разбавленного спирта (3 мл воды и 22 мл спирта) с последующим разбавлением раствора водой в 2 раза. Содержимое пробирок энергично встряхивают в течение 10 с, ставят в штатив и погружают в бурно кипящую водяную баню, замечают начало кипения воды в бане, которое должно возобновиться через 0,5 мин, и выдерживают раствор в бане 5,5 мин. Общее время выдержки проб в бане должно быть 6 мин. Затем штатив с пробирками вынимают, помещают в баню с проточной водой (температурой 8—10° С) и охлаждают жидкость до 20° С.

Раствор после реакции приобретает сине-зеленую окраску. В окрашенных растворах определяют оптиче­скую плотность на фотоэлектроколориметре по инструк­ции, прилагаемой к прибору, в кювете с длиной грани 0,5 см и при длине световой волны λ= 610 нм, снимая показания по красной шкале левого барабана. Если окажется, что оптическая плотность раствора больше 0,800 или меньше 0,150, то анализ повторяют, уменьшая или увеличивая количество основного раствора для при­готовления рабочего. Если при анализе оптическая плотность будет находиться в указанных пределах, полученные данные используют для определения осахаривающей активности по следующему уравнению:

ОС=

Пример. Для анализа взят ячменный солод влажностью 42,0%. Приготовлена вытяжка 5 г солода на 100 мл воды с фосфатным бу­фером; для вторичного разбавления взято 2 мл вытяжки на 100 мл воды.

В 5 мл разбавленного раствора находилось

=0,005 г

солода (n=5). При колориметрировании получили значение оптической плотности 0,652.

Осахаривающая активность солода

ОС= =19,36 ед/г

или на абсолютно сухое вещество солода при влажности его 42%

=33,38 ед/г