Определение ферментативной, активности

Ферментативную активность плесневых грибов ха­рактеризуют амилолитическая, декстринолитическая, глюкоамилазная и протеолитическая активность.

Амилолитическую активность культур плесневых грибов определяют колориметрическим, йодометрическим методом, как и в солоде.

Для анализа поверхностной культуры из средней пробы отбирают две навески; для определения влажности и амилолитической активности.

Для определения АС берут 5 г воздушно-сухой или 10 г сырой культуры, тщательно растирают с кварцевым песком или толченым стеклом в фарфоровой ступке и количественно переводят в стакан или коническую кол­бу, добавив 10 мл ацетатного буферного раствора с рН 4,7 и 90 мл дистиллированной воды. Смесь выдер­живают в течение часа в термостате при 30° С, периоди­чески перемешивая. Затем раствор отфильтровывают, и фильтрат используют в качестве основного раствора для приготовления рабочего раствора фермента, как описа­но при определении ферментативной активности солода. Ориентировочный расход основного раствора на приготовление рабочего раствора фермента нужной концентрации определяют по табл. 4.

Таблица 4 Приготовление рабочих растворов

(основной раствор содержит воздушно-сухой культуры 5 г/100 мл)

При анализе глубинной культуры отделяют мицелий фильтрацией, и фильтрат используют для при­готовления рабочего раствора фермента.

Для этого берут от 1 до 5 мл фильтрата (в зависи­мости от предполагаемой активности культуры) и раз­водят дистиллированной водой в мерной колбе на 100 мл. С рабочим раствором проводят ферментативную реакцию гидролиза крахмала в указанных выше усло­виях и проводят определение, как это описано для соло­да.

Активность определяют по числу единиц, содержа­щихся в 1 г поверхностной или в 100 мл глубинной культуры. Расчет ведут по уравнениям:

для поверхностной культуры

АС=

для глубинной культуры

АС=

где n₂— число миллилитров глубинной культуры, взятое на анализ.

Пример.Для анализа взято 10 г поверхностной культуры Asp. oryzae. Предполагаемая активность (штамм гриба высокоэффек­тивен по амилазе) лежит в пределах 160—200 ед./г. По табл. 15 находим количество раствора, которое необходимо взять. Для вто­ричного разбавления— 1 мл/200 мл. В таком случае n=2,5 мг.

При колориметрировании получаем значения оптической плот­ности

D₁=0,750 и D₂=0,423.

Количество прогидролизованного крахмала

C= =0,04361 г

Амилолитическая активность культуры составит

АС= =111,6 ед/г.

Осахаривающую активность(метод ВНИИПрБ) культур грибов определяют с применением колоримет­рического антронового метода по прописи, приведенной для анализа солодов. Определение можно вести в той же реакционной среде, которую приготовили для определения АС.

Осахаривающую активность ОС культур грибов по полученной оптической плотности определяют по урав­нению

ОС=

где D — оптическая плотность раствора;

п — масса культуры, взятой на ферментативную реакцию, мг.

Пример. На анализ взята поверхностная культура гриба Asp.oryzae n=2,5мг. После реакции получен раствор с оптической плот­ностью D=0,450.

Осахаривающай активность составит

ОС= = 25,85 ед./г.

Определение протеолитической активности (метод ВНИИФСа)

Протеолитическая активность характеризует способ­ность ферментов катализировать расщепление белков до пептидов и аминокислот. Культуры плесневых грибов характеризуются числом единиц протеолитической ак­тивности (ПАк), содержащихся в 1 г исследуемого ма­териала.

За единицу протеолитической активности принима­ется такое количество ферментов, которое катализирует расщепление 1 г белка в строго стандартных условиях (температура 30° С; рН среды 7,0; продолжительность протеолиза 30 мин; постоянное соотношение фермент — субстрат в среде, обеспечивающее гидролиз белка на 50% до продуктов, не осаждающихся трихлоруксусной кислотой за 30 мин).

В основу определения протеолитической активности положена зависимость степени протеолиза белка от числа единиц фермента, взятого на анализ для прове­дения ферментативной реакции.

Количество превращенного белка определяют с при­менением интерферометрического метода. Активность ферментных материалов определяют по специально выведенному графику (или уравнению), на котором по оси ординат отложена разность показателей преломле­ния, а по оси абсцисс — число единиц фермента.

Относя полученную величину к 1 г исследуемого ферментного материала, определяют его активность в условных единицах.

Для определения протеолитической активности по­верхностной культуры готовят вытяжку из нее (5 г воздушно-сухой или 10 г сырой культуры на 100 мл), при определении в глубинной культуре ее разбавляют описанным выше способом.

Для приготовления рабочего раствора берут различ­ное количество основного раствора в зависимости от предполагаемой активности культуры и разбавляют дистиллированной водой до 50 или 100 мл.

B качестве субстрата используют 1%-ный раствор казеина.

Ход определения.В пробирку высотой 180 мм и диаметром 20 мм берут 10 мл субстрата и помещают ее в ультратермостат с температурой 30±0,2°С на 5—10 мин, чтобы раствор принял необходимую темпе­ратуру. Затем, не вынимая пробирки из термостата, наливают в нее 5 мл рабочего ферментного раствора (испытуемая проба), смесь перемешивают и выдержи­вают в термостате в течение 30 мин для протеолиза белка под действием исследуемых ферментов. По исте­чении этого времени в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлоруксусной кислоты для инактива­ции фермента и осаждения высокомолекулярных про­дуктов протеолиза, жидкость перемешивают и смесь выдерживают в том же ультратермостате (t = 30° С) в течение 15 мин.

Одновременно ставят контрольный опыт, для чего в пробирку наливают 10 мл 4%-ного раствора трихлор­уксусной кислоты и приливают 5 мл ферментного раствора, который инактивируется под действием кис­лоты. Содержимое пробирки перемешивают, выдержи­вают 5 мин, приливают к смеси 10 мл субстрата и ставят в ультратермостат с температурой 30° С на 15 мин для осаждения белка. Затем пробирки вынимают из термостата, охлаждают до комнатной температуры и фильтруют содержимое через бумажный складчатый фильтр. В прозрачном фильтре определяют интерферен­цию на интерферометре марки ИТР-2 и снимают показания т на бара­бане прибора. Показания барабана определяются раз­ностью показателей преломления (А∆) двух сравнивае­мых жидкостей, поэтому для простоты расчета при ана­лизе можно пользоваться этим показанием.

При работе с прибором используют кювету с длиной грани 2 см, наливая в правую еекамеру контрольный, а в левую— испытуемый растворы. Для обеспечения точности анализа необходимо, чтобы в процессе фер­ментативной реакции в продукты, не осаждаемые три­хлоруксусной кислотой, перешло 20—75% белка. Дляэтого на анализ необходимо брать такое количество культуры, чтобы показания барабана интерферометра т не превышали 500. Значение т пропорционально разности показателей преломления, которая в данном слу­чае определяется количеством образовавшихся при гидролизе белка продуктов, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой (аминокислот и .пептидов). Количество этих продуктов определяет скорость ферментативной реакции гидролиза белка, а, следовательно, и активность исследуемого материала в принятых единицах.

Активность протеолитических ферментов (ПС) опре­деляют по специально разработанному уравнению, под­ставляя в него полученные при анализе показания бара­бана интерферометра т

ПС=

где 0,1702 и 10,213 — коэффициенты, найденные экспериментально.

Пример.На анализ взята поверхностная культура гриба Asp. oryzae.

Приготовлен основной раствор с содержанием 5 г культуры в 100 мл. На приготовление рабочего раствора взято 7,5 мл основного, и объем его доведен до 50 мл дистиллированной водой. В 5 мл такого рабочего раствора содержится 0,0375 г культуры (n = 37,5 мг).

При анализе получено показание интерферометра m = 320. Протеолитическая активность культуры составит

ПС= = 1,18 ед./г.