Для инвалидов «Профессионально-реабилитационный центр»

Для инвалидов «Профессионально-реабилитационный центр»

УТВЕРЖДАЮ

Директор

Г.Г. Иванов

___ __________20 __ г.

ВЫПУСКНАЯ КВАЛИФИКАЦИОННАЯ РАБОТА

Проведение лабораторных исследований
по диагностике мочекаменной болезни

Специальность 31.02.03 Лабораторная диагностика

К защите допущен: _______________

Выполнена обучающимся группы МЛТ 18-3

Марковым Леонидом Павловичем

Научный руководитель: Зубова Татьяна Федоровна

Рецензент: __ Палканова Мария Сергеевна

Cанкт – Петербург

2016 г.

Оглавление

Введение. 3

Теоретическое обоснование будущих разработок. Возможность выбора методологии и методики проведения качественного и количественного анализа в котором находится современная диагностика мочекаменнной болезни. Характеристика состояния вопроса. Актуальность выбранной темы. Цель работы. Комплекс задач, направленных на удовлетворение этой цели. Объект исследования. Новизна. Место проведения исследования. Методы, используемые для выполнения исследования. Объем исследования.

Основная часть:

Глава I. Обзор литературных данных. 4

I.I. Исторические сведения. 4

I.2. Эпидемиология мочекаменной болезни. 7

I.3. Этиология и патогенез мочевых камней (кратко) 8

I.4. Лабораторные методы диагностики мочекаменной болезни (МКБ) 12

Теоретический анализ темы на основе имеющейся литературы.

Глава II. (собственные исследования) 12

Методика, расчеты, анализ экспериментальнополученных данных, продукт творческой деятельности. Характеристика объектов и методов исследования, полученные результаты и их анализ, статистическая обработка результатов исследования с указанием коэффициентов достоверности; Иллюстрации.

Список использованной литературы: 26

ПРИЛОЖЕНИЕ.. 27

Смотри подготовку пробирок к исследованию на электролиты Na k Ca!

Введение

! Еще доработать. В этой главе дается характеристика состояния исследуемого вопроса, обосновывается выбор темы, определяемый ее актуальностью. Указывается цель работы, указывается объект исследования, методы и объем исследования, место проведения исследования. (См. МР)

Актуальность.

Забор материала при исследовании на МКБ бывает сложным, лежачим больным, имеющим нарушение оттока мочи требуется катетеризация. Данное заболевание приводит к временной, а в отдельных случаях и постоянной утрате трудоспособности людьми молодого и среднего возраста, составляющими экономически активное население. Заболевание носит хронический рецидивирующий характер. Распространено повсеместно. Ухудшает прогноз основного заболевания почек.

Приходится считаться с тем, что успех диагностики мочекаменной болезни зависит от правильности сбора мочи и крови средним медперсоналом, от своевременности доставки в лабораторию и временного интервала до начала анализа. Немаловажен факт, что современные лаборатории переходят на полностью автоматизированный режим сортировки и, непосредственно, проведения исследований. В качестве преимуществ можно отметить резкое увеличение потока обслуживаемых пациентов, расширение информационной системы здравоохранения, что делает результаты анализов более доступными для адресатов (больных, врачей), исчезает необходимость повторного исследования, спектр показателей в исследуемых пробах биоматериала неуклонно расширяется. Однако вопреки всему, недостатки такого подхода видны невооруженным взглядом: малая транспортная доступность межрайонных лабораторий, высокая себестоимость анализов и частые перебои функциональности анализаторов, удлиняются сроки оказания медицинской помощи.

Цель работы

Целью моей выпускной работы считаю узнать, какие возможности современной лаборатории применимы для увеличения точности, специфичности и скорости диагностики мочекаменной болезни.

Задачей исследования является ознакомление с принципами методов, используемых в автоматизированной диагностике мочекаменной болезни, с особенностями работы на анализаторах сыворотки крови и мочи используемыми для дифференциальной диагностики МКБ.

Основной материал- сыворотка крови и моча, осадок мочи, которые исследуются на нарушение обмена солей, кальция, фосфора, магния.

Актуальность вариант №2

В странах, в том числе и России, все чаще констатируется тенденция к росту заболеваемости мочекаменной болезнью [1]. Мочекаменная болезнь одна из форм проявления заболеваний обмена веществ, которая по прогнозу ученых будет иметь дальнейшую тенденцию к росту в связи произошедшими существенными изменениями характера и качества питания людей, увеличением числа неблагоприятных экологических и социальных факторов, оказывающих как прямое, так и опосредованное действие на организм человека. Актуальность проблемы уролитиаза обусловлена тем, что в 65-70% случаях болезнь диагностируется у лиц в возрасте 20-55 лет, т.е. в наиболее трудоспособном периоде жизни. Настораживает тот факт, что все чаще мочекаменная болезнь стала диагностироваться у детей даже грудничкового возраста [2, 3, 4]. Несмотря на широкое внедрение новых высокоэффективных, неинвазивных методов диагностики и лечения мочекаменной болезни, частота рецидива продолжает оставаться высокой до 38,4% наблюдений [5].

В связи с этим особую актуальность приобретает диагностика, профилактика и лечения

Любое лечебно-профилактическое учреждение должно быть оснащено оборудованием, позволяющим диагностировать мочекаменную болезнь на современном уровне. Лечение должно дополнять более детальное обследование определение состава камня, состояние обменных нарушений крови и мочи, посев мочи с определением антибиотикочувствительности, исследование гормонального фона, выявление сопутствующих заболеваний, предрасполагающих к уролитиазу и др.

Детская заболеваемость МКБ

Важно, что за последнее время отмечается прогрессивный рост заболеваемости мочекаменной болезнью среди детского населения России. Исследования, проведенные в НИИ урологии [9], позволили выделить факторы риска развития мочекаменной болезни в детской возрастной группе.

Факторы риска камнеобразования у детей:

• наличие в анамнезе у ближайших родственников факторов риска развития уролитиаза, урологических заболеваний, особенно мочекаменной болезни, сопровождающихся метаболическими нарушениями камнеобразующих веществ 68,5% наблюдений;
• наличие аномалий мочевыделительной системы у ребенка 21,2% наблюдений;
• проживание семьи в экологически неблагоприятных условиях 88,5% наблюдений;
• наличие у родителей вредных привычек (курение, потребление алкоголя) 16,6% наблюдений;
• особенности течения беременности у матери отягощенная беременность на фоне токсикоза (82,7% наблюдений) и, в особенности, гестоза (16,1% наблюдений), прием противовирусных и антибактериальных препаратов (16,6% наблюдений).

I.I. Исторические сведения

Мочекаменная болезнь была известна уже в глубокой древности. Бальзамирование трупов в Египте за несколько тысячелетий до нашей эры позволило обнаружить у некоторых мумий камни в почках и мочевых путях. Самый древний камень найден Смитом в 1901 г. около египетской деревни Эль-Альма в мумии, захороненной 7000 лет назад.

Подобные сведения можно найти в трудах Гиппократа, Галена, Цельса, Авиценны и других ученых древности.

В древних папирусах египтян сохранились описания местного лечения камней мочевого пузыря.

Специальные деревянные и костяные трубки применялись для введения воздуха в мочевой пузырь. Затем «мастер-камнесек» наносил направленный удар по животу, что приводило к смещению камня в мочеиспускательный канал. Здесь он фиксировался пальцами снаружи. Искусным движением камнесека стенки мочеиспускательного канала рассекались, и конкремент мгновенно удалялся. Операция производилась без применения обезболивающих средств. Такие манипуляции и оперативные вмешательства требовали от «камнесеков» исключительной сноровки. Следует отметить, что камнесеки не были врачами и причислялись к ремесленникам и цирюльникам.

Изучением причин мочекаменной болезни, ее симптомов и лечением занимались многие врачи древности.

Гиппократ (460-370 годах до н. э.) описал почечную колику и ее лечение тепловыми процедурами.

Гален связывал камнеобразование с расой, климатом, диетой и приемом алкоголя, ревматизмом, составом воды и неправильным обменом веществ. Упоминал в своих работах о нагноении почек как об одном из осложнений мочекаменной болезни.

Цельс (I век до н. э.) описал боковое камнесечение. Он рекомендовал удалять камни оперативным путем в возрасте 9-14 лет.

Авиценна (980-1037 гг.), разрабатывал методы диагностики МКБ, объяснял возникновение камней двумя причинами: одна из них связывалась с особенностями питания, другая - с обстоятельствами, ухудшающими отток мочи. В частности, большое значение он придавал сужению мочеиспускательного канала у мальчиков и мужчин.

В Древней Руси было широко распространено лечение мочекаменной болезни сборами трав, нередко сопровождавшееся различными языческими обрядами.

В XVI в. в Москве возник первый орган управления медицинской помощи в России — Аптекарская изба. В 1620 г. был создан Аптекарский приказ. Появился контроль за работой бродячих камнесеков. В своей работе они уже применяли некоторые методы санитарии. Так, больным перед камнесечением рекомендовалось сходить в баню. Назначались слабительные, а инструменты перед операцией прокаливались над огнем. В средние века профессия камнесека была нередко потомственной.

При раскопках Помпеи (I в. н. э.) были найдены мужские и женские катетеры.

Первая инструментальная изба, на месте которой вырос со временем завод медицинского оборудования «Красногвардеец», была основана в Петербурге еще Петром I. Сам Петр, будучи урологическим больным, изготовил набор различных бужей и владел техникой бужирования. В XVIII в. появились врачи, оперирующие по поводу мочекаменной болезни (Н. Ф. Арендт, С. И. Иноземцев, В. А. Басов, И. Ф. Буш, X. X. Саломон, И. В. Рклицкий, И. В. Буяльский, Н. И. Пирогов.

И. П. Венедиктов создал школу по подготовке операторов.

Н. И. Пироговым была изучена и описана топографическая анатомия почек, забрюшинного пространства и таза.

Одним из основоположников отечественной урологии считают С. П. Федорова. Им были разработаны оперативные доступы на почках для удаления камней. Он первым в России применил цистоскопию, катетеризацию почки, ретроградную пиелографию.

В настоящее время причины мочекаменной болезни, механизм камнеобразования изучаются на высоком научном уровне, включая электронную микроскопию, гистохимию и сложные биохимические и рентгеноструктурные исследования. В диагностике используются рентгенологические методики и различные лабораторные исследования. В лечении больных широко применяется этиотропная терапия, оптические инструменты, ультразвук и лекарственные препараты.

Методика гидравлического удара, разработанная Юткиным Л. А., 1955; Единым Ю. Г., Л. А., 1960 позволила создать аппараты дистанционной литотрипсии. Все более широкое распространение получает чрескожная пункционная нефро- и уретролитотомия и литотрипсия, лапароскопические и перитонеальные операции.

Этиология и патогенез

В настоящее время не существует единственной теории патогенеза мочекаменной болезни. Выделяют два типа процессов, которые определяют факторы формального и каузального генеза камнеобразования.

Формальный генез Согласно кристаллизационной теории, процесс образования камней подчиняется принципам кристаллизации. В этом процессе матрица не имеет существенного значения и считается случайной составной частью. С позиции коллоидной теории, первым и важнейшим шагом при возникновении камней является образование органической матрицы камня, а кристаллизация на ней мочевых солей является вторичным процессом. Для начала кристаллизации практически во всех случаях необходима высокая концентрация камнеобразующих веществ в моче. В конечном счете причиной образования камней рассматриваются нарушения количественного и качественного соотношения между солями мочи и ее защитными коллоидами, которые одерживают соли в растворенном состоянии. В то же время известно, что даже в нормальных условиях моча довольно часто бывает перенасыщена камнеобразующими веществами (при обильном питании, тяжелой физической работе и др.), однако камнеобразования не происходит. В настоящее время выявлен ряд веществ, влияющих на коллоидную стабильность и поддержание солей в растворенном состоянии, и наоборот, их отсутствие способствует кристаллизации солей. В нормальной моче этими веществами являются мочевина, креатинин, гиппуроновая кислота, хлорид натрия, цитраты, магний, неорганический пирофосфат и др. Метастабильное состояние соли в насыщенном растворе легко может быть разрушено. В некоторых случаях эту роль играют мукопротеины, сульфаниламиды, пировиноградная кислота, коллаген, эластин. Реакция мочи (pH) — также является одним из существенных факторов образования камней. Доказано, что повышение концентрации и экскреции камнеобразующих веществ — мочевой кислоты, кальция, неорганических фосфатов, оксалатов — бесспорное условие, способствующее образованию камней.

Каузальный генез В основе каузального генеза лежит ряд экзогенных и эндогенных факторов риска, приводящих к органическим и функциональным состояниям, благоприятствующим формальному генезу. Так, однообразное питание с преобладанием растительной или молочной пищи способствует ощелачиванию мочи, тогда как мясная пища — окислению.

Экзогенные этиологические факторы 1. Климат, биогеохимическая структура почвы, физико-химические свойства воды и флоры, пищевой и питьевой режим населения. 2. Условия труда (вредные производства, горячие цеха, тяжелый физический труд и др.) и особенности быта (однообразный, малоподвижный образ жизни и отдыха). 3. Чрезмерное и однообразное потребление с пищей большого количества камнеобразующих веществ, воздействующих на концентрацию протекторов камнеобразования, pH, диурез и т.д. 4. Недостаток витаминов А и группы В. 5

. Эндогенные этиологические факторы риска могут быть самой различной природы. К ним относятся как местные урологические факторы риска, так и общие факторы риска, а также интеркуррентные заболевания пациента. Эндогенные этиологические факторы Урологические факторы 1. Местные врожденные и приобретенные изменения мочевых путей (стриктуры, добавочные сосуды, приводящие к нарушению оттока и гидронефрозов). 2. Единственная (единственно функционирующая) почка. 3. Пузырно-мочеточниковый (почечный) рефлюкс. 4. Аномалии мочевых путей — губчатая, подковообразная почка, уретероцеле, отшнурованные чашечки. 5. Инфекция мочевых путей. Общие факторы 1. Состояния дефицита, отсутствия или гиперпродукции ряда ферментов - гиперпаратиреоз, подагра. 2. Длительная или полная иммобилизация (переломы костей позвоночника, таза и др.). 3. Заболевания желудочно-кишечного тракта, печени и желчных путей. 4. Резекции кишечника, тонкотолстокишечные анастомозы. 5. Болезнь Крона, Педжета, Бека. 6. Повышенное назначение витаминов А, С, сульфаниламидов. 7. Саркоидоз, лейкемия и метастатические поражения костей.

Перечисленные выше факторы приводят к образованию камней в почках, которые на сегодняшний день подразделяются согласно химической их классификации на: мочекислые камни (ураты) — желто-коричневого цвета плотной консистенции с гладкой или мелкозернистой поверхностью; оксалатные камни - темно-бурого, почти черного цвета, очень плотные, с шероховатой поверхностью, усеянной «шипами»; фосфатные камни (инфицированные) - серовато-белого цвета, мягкие, легко крошатся, поверхность их шероховатая; смешанные камни — ядро образуется из одних солей, а оболочка — из других; цистиновые камни — светло-коричневого цвета, самые плотные, с гладкой поверхностью. Структура камней имеет значение для оценки обменных нарушений, происходящих в организме, что позволяет выработать тактику метафилактики мочекаменной болезни. В настоящее время знание физико-химических свойств мочевого камня позволяет правильно выработать показания и методику дистанционной ударно-волновой и контактной эндоскопической литотрипсии. Лопаткин Н.А., Пугачев А.Г., Аполихин О.И. и др. Урология

Вариант № 2

Мочекаменная болезнь является полиэтиологическим заболеванием.

Предрасполагающие факторы:

ü Проживание в эндемичных регионах, где вода имеет повышенные жесткость, кальций и магний увеличивает частоту камнеобразования.

ü Наследственная предрасположенность.

ü Нарушение питания (Избыточное потребление острой, кислой пищи, животного белка);

ü Гиперкальциурия.

ü Обменные заболевания (подагра);

ü Недостаток витамина A; D, передозировка витамина D.

ü Пиелонефрит, длительный прием сульфаниламидов, тетрациклинов, антацидов, ацетилсалициловой кислоты, глюкокортикоидов, антацидов, нитрофуранов.

ü Длительная иммобилизация.

ü Нарушения уродинамики (стриктуры мочеточника, первичные и вторичные стенозы лоханочно-мочеточникового сегмента, аномалии мочевых путей, нефроптоз, пузырно-мочеточниковый рефлюкс, инфекции мочевых путей.)

ü Другие заболевания (гиперпаратиреоз, остеомиелит, остеопороз, пиелонефрит, цистит).

При наличии патогенетических условий, в результате дистрофии эпителия почечных канальцев в белковом и полисахаридном обмене происходят изменения, приводящие к образованию конкрементов.

Согласно коллоидной теории моча перенасыщена растворенными минеральными солями и удерживающими их в растворенном виде мелкодисперсными белками, обеспечивающими качественное и количественное коллоидно-кристаллоидное равновесие.

При нарушении количественных и качественных соотношений между коллоидами и кристаллоидами в моче может начаться патологическая кристаллизация.

При наличии кислой ph в моче образуются ураты, щелочной-фосфаты, оксалаты.

Кофеин, повышая основной обмен, увеличивает образование мочевой кислоты. Некоторые авторы отмечают потребление неочищенного риса как фактор для возникновения МКБ.

Многие авторы придают значение нарушению оттока мочи (обструкция, изменение уродинамики), что, однако, не может быть первопричиной камнеобразования.

В литературе имеются данные о возможной зависимости эпителиальных телец от функции других эндокринных органов: гипофиза, щитовидной железы, половых органов, поджелудочной железы, вилочковой железы.

Стриктуры мочеточника, первичные и вторичные стенозы лоханочно-мочеточникового сегмента создают препятствие отхождению мочи из почечных лоханок, движению ее по мочевым путям.

Пузырно-мочеточниковый рефлюкс вызывает обратный заброс мочи из мочевого пузыря в мочеточники.

Инфекции мочевых путей приводят к возникновению воспаления местного характера, сужению просвета мочеточника. Скорость движения мочи замедляется.

При нефроптозе почка может перемещаться больше чем на 2 см в вертикальной плоскости, что создает трудности отхождения из нее мочи.

Морфологические изменения в почке зависят от локализации камня, его величины, формы и анатомических особенностей почки, наличия в ней воспалительного процесса.

Часто камни возникают на фоне пиелонефрита и нарушают отток мочи, способствуя, прогрессивному течению пиелонефрита.

Нарушение оттока мочи при МКБ, не осложненной пиелонефритом, индуцирует сначала альтернативно-экссудативные и продуктивные, а затем атрофические и склеротические процессы в почечной лоханке, а впоследствии - и в интерстициальной ткани почки, канальцы и клубочки расширяются, возникают пери- и эндартерииты.

При наличии инфекции воспалительный процесс распространяется в направлении от мозгового до коркового слоя, поражая как канальцы, так и клубочки с возможностью пионефроза. При поражении канальцев почек повышается образование мукопротеидов, и нейтральных мукополисахаридов, образующих цилиндры на слизистой оболочке почечных клубочков и в просвете почечных канальцев. В случае дальнейшего развития изменений постепенно наступает атрофия почечной ткани.

Гистохимические и электронно-микроскопические исследования показывают:

в промежуточной ткани почки и базальных мембранах капилляров клубочков происходит чрезмерное накопление гликопротеидов, мукополисахаридов, включая гиалуроновую кислоту.

Склероз и атрофия ткани приводят к жировому перерождению почечной паренхимы.

Повышение внутрилоханочной давления, нарушает внутрипочечную гемодинамику, лоханочно-почечные рефлюксы.

Однако, в организме существуют механизмы препятствующие образованию камней:

К числу которых относятся ph мочи (5,8-6,2. обеспечивает стабильное коллоидное состояние растворенных веществ в моче.), и компоненты мочи (ионы магния, цинка, неорганический пирофосфат, гликозамингликаны, нефрокальцин, белок Тамма-Гольсфалла).

Классификация камней:

Неорганические:

Кальциевые (оксалатные; фосфатные; карбонатные)-75-85%

Магневые-5-10%

Органические:

Уратные-5-10%

Аминокислотные (цистиновые)-0,4-0,6%

Кальциевые камни чаще обнаруживают у мужчин старше 20 лет.

Аминокислотные камни связаны с врожденными нарушениями обмена аминокислот.

I.4. Лабораторные методы диагностики мочекаменной болезни (МКБ)

Вариант № 2

· Таблица 3. Объем контрольного обследования пациентов в соответствии с типом ЛПУ

Вариант №1

Обычно изменений в показателях общего анализа крови не наблюдается. Однако при возникновении почечной колики или формировании пиелонефрита, может отмечаться лейкоцитоз , сдвиг лейкоцитарной формулы влево, увеличение СОЭ.

Эритроцитопения свидетельствует о хроническом течении или тяжелой степени гематурии.

Гипереурикозурия и гиперурикоземия может указывать на нарушение синтеза мочевой кислоты, что имеет место при мочекислом диатезе, подагре и почечной недостаточности, может служить причиной МКБ.

Кристаллы мочевой кислоты с рН мочи менее 6,0 характерны для уратного нефролитиаза и мочекислого диатеза;

Фосфаты кальция и магния при рН мочи 7,0 и выше - для фосфатного уролитиаза;

Гиперфосфатурия (повышение уровня фосфора) может быть проявлением фосфатного диатеза, врожденного или приобретенного вследствие первичных заболеваний желудка или центральной нервной системы.

Оксалаты кальция - для кальций-оксалатного уролитиаза или оксалурического диатеза

При гиперкальциемии исследуют гормоны (кальцитонин и паратгормон) при диагностике гиперпаратиреоидизма, особенно у больных с коралловидными, двусторонними и рецидивными камнями, возможной причины мочекаменной болезни.

Гиперкальциемия, снижение уровня фосфора и магния в сыворотке крови - признаки нарушенного метаболизма, которые рассматриваются как факторы риска рецидивного камнеобразования и требуют исключения почечной формы первичного гиперпаратиреоидизма.

Креатинин вместе с мочевиной определяют для оценки степени поражения почек, нарушения их функции фильтрации, секреции, реабсорбции.

А.В. Козлов, доктор медицинских наук,
Е.С. Ларичева,
Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования,
Санкт-Петербург, Россия

Проведен анализ литературы, посвященной методам определения креатинина в крови и моче. Представленные в обзоре данные указывают на то, что большинство методических проблем, связанных с его определением с помощью химических и энзиматических методов, решены. Референтные интервалы при использовании более специфичных энзиматических методов обычно ниже по сравнению с методами, основанными на реакции Яффе.

Содержание креатинина в крови является тем лабораторным параметром, который традиционно используют для оценки функции почек. Определяют креатинин с помощью реакции, предложенной М. Яффе в 1886 г. [1].

В клиническую практику данную реакцию ввел O. Фолин в 1904 г. [2]. Благодаря своей простоте, она широко используется до настоящего времени.

Несмотря на то что реакция известна более 100 лет, ее химизм до конца не выяснен. Реакция протекает между креатинином и пикрат-ионом, образующимся в щелочной среде [3].

[пикрат] + [ОН^–] ------> [пикрат–ОН^–]
[пикрат–ОН^–] + [креатинин] <------> [пикрат –креатинин]

Поглощение комплекса креатинин-пикрат обычно определяют в интервале длин волн 510–520. Пикрат-ион, присутствующий в реакционной среде в избытке, обладает поглощением при длине волны ниже 500 нм (рис. 1).

Строение комплекса «креатинин-пикрат» окончательно не установлено. Комплекс с соотношением компонентов — пикриновая кислота : креатинин (1 : 1) — получил название комплекса Яновского [3]. При избытке креатинина комплекс «пикриновая кислота : креатинин : NaOH» (1 :2: 3) окрашен в желтый цвет, при ином соотношении этих компонентов (1 : 1 : 2) комплекс приобретает красноватый оттенок (рис. 2 ).

Скорость образования креатинин-пикратного комплекса постоянна при температуре ниже 30 °С. При повышении температуры глюкоза, мочевая, аскорбиновая кислоты приобретают способность превращать пикриновую кислоту в пикраминовую, обладающую максимумом поглощения при длине волны 482 нм, что приводит к ложному завышению результатов определения креатинина. При повышении температуры происходит увеличение поглощения пикрат-иона и продукта реакции креатинин-пикрата.

Величина рН является другим важным фактором, определяющим скорость реакции. При определении креатинина в биологических жидкостях решающее значение приобретает величина рН в исследуемом образце, контроле и стандартном растворе креатинина. Его значение должно быть постоянным и заключаться в интервале 12–12,5. Несоблюдение этого условия может приводить к систематической ошибке. Разница в значении рН реакционной среды, опытной, контрольной пробы и стандартного раствора может быть значительной в тех случаях, когда стандартные растворы готовят на растворах соляной кислоты.

Важное значение имеет выбор депротеинизируещего агента и его концентрации. Большинство исследователей считают, что наиболее целесообразно осаждать белки теми денатурирующими агентами, при которых рН фильтрата или центрифугата лежит ниже 2,5. Особое место среди модификаций реакции Яффе занимает метод, предложенный H. Popper, в котором пикриновая кислота используется и для осаждения белков, и постановки самой реакции Яффе. По мнению многих исследователей, данный метод является специфичным, так как большая часть некреатининовых хромогенов адсорбируется на денатурированном белке и выводится из реакции после центрифугирования или фильтрования. В связи с тем, что калибровку проводят водными растворами креатинина, имеет место систематическая ошибка.

Поскольку концентрация креатинина в сыворотке низка, реакцию стараются проводить при оптимальных значениях рН в интервале 12,3–12,5. Для изменения рН раствора с ~2,5 до 12,5 требуются растворы гидроксида натрия с точной концентрацией, не содержащие примесей карбонатов. Зависимость чувствительности реакции от значения рН настолько велика, что концентрация щелочи в среде может играть решающую роль. В связи с этим нельзя пользоваться «старыми» растворами щелочи.

Скорость образования комплекса линейно зависит от концентрации ОН^– ионов в широком диапазоне концентрации пикриновой кислоты [3]. Их концентрация определяет не только скорость реакции, но также спектральную кривую поглощения комплекса в интервале длин волн от 485 до 520 нм. В большинстве современных методов стараются использовать концентрацию гидрокисида натрия менее 1,0 моль/л, часто она ниже 0,5 моль/л. Для обеспечения большей аналитической чувствительности и специфичности следует использовать фотометры с узкополосными светофильтрами, позволяющие проводить фотометрию в интервале длин волн от 505 до 520 нм.

Повышение специфичности реакции Яффе
Поскольку реакция Яффе не является специфичной для определения креатинина в плазме, длительное время подбирали такие условия реакции, при которых воздействие различных посторонних соединений на формирование комплекса «креатинин-пикрат» было бы минимальным, либо их количество можно было бы точно оценить [4].

Для этого использовали следующие приемы:
— пределяли поглощение различных интерферирующих соединений после расщепления креатинина микроорганизмами Corynebacterium ureafaciens;
— выводили подобные соединения из реакционной среды с использованием различных адсорбентов;
— выделяли креатинин из исследуемого материала и проводили реакцию.

При проведении реакции Яффе с депротеинизированной сывороткой выделяют три основные группы веществ, вступающих в реакцию с пикриновой кислотой:
— группу быстро реагирующих «хромогенов»;
— сам креатинин;
— группу медленно реагирующих «хромогенов».

К «некреатининовым» хромогенам, вступающим в реакцию Яффе, относят глюкозу, аскорбиновую кислоту, гуанидин, ацетон, цефалоспорины, -кетокислоты — ацетоуксусную и пировиноградную [5, 6].

В зависимости от метода перечисленные (псевдо) креатинины способствуют ложному завышению уровня «истинного» креатинина в плазме на 0,2–0,4 мг/100 мл. При совершенствовании методов, основанных на реакции Яффе, основное внимание уделялось плазме, поскольку в моче интерферирующих соединений содержится относительно немного [7]. В проточных анализаторах вмешательство в реакцию белков смогли устранить путем проведения диализа, в неавтоматизированных методах белки осаждали или добавляли в среду детергент (додецилсульфат натрия) для образования белковых комплексов, не вступающих в реакцию с пикриновой кислотой. Для связывания глюкозы и аскорбиновой кислоты в реакционной среде использовали соли борной кислоты [8].

В ряде популярных в свое время методов креатинин отделяли от других хромогенов с помощью сорбентов: бентонита, Фулеровой земли, реактива Ллойда. Все указанные соединения обладают высокой адсорбирующей способностью, после добавления к безбелковому фильтрату через 1 минуту они способны связать более 92 % креатинина. После центрифугирования и удаления надосадочной жидкости, содержащей некреатининовые хромогены, к осадку добавляли щелочной пикрат и определяли содержание креатинина. Использование реактива Ллойда [9] или ионообменной смолы [10] для адсорбции и устранения некреатининовых хромогенов повышало специфичность метода, но усложняло процедуру определения [11].

Для неавтоматизированных методов обычно используют методы, в которых окраска комплекса проявлялась при комнатной температуре через 10–15 мин.

Для повышения специфичности метода и ускорения процедуры определения для автоанализаторов были разработаны, так называемые, кинетические методы, основанные на измерении скорости псевдореакции первого порядка — образования комплекса «креатинин–пикрат». При их разработке авторы подчеркивали необходимость поддержания стабильной температуры для получения воспроизводимых результатов [12]. В сыворотке были идентифицированы два типа соединений, вмешивающиеся в протекание кинетического метода: «некреатининовые» хромогены, образующиеся преимущественно на протяжении первых 20 с после смешивания реагента и образца, и хромогены, образование которых ускоряется через 80–100 с инкубации [13]. Промежуток времени между 20 и 80 с, получивший название «окно», представляет собой тот промежуток времени, когда регистрируемая скорость реакции обусловлена преимущественно взаимодействием креатинина и пикрат-ионов. Некоторые исследователи утверждают, что 60 с — верхний предел данного промежутка. Повышение специфичности кинетических методов было достигнуто путем регистрации скорости реакции в интервале от 25 до 60 с после запуска реакции. Данный подход был использован в различных автоанализаторах [14].

Обзор кинетических методов, проведенный L. Bowers и E. Wong, показал, что многие из этих методов все же остаются чувствительными к кетокислотам, билирубину и продуктам его расщепления [12]. При их сравнении было установлено, что для определения скорости реакции более надежным является метод построения кривой по нескольким точкам, чем «двухточечное» определение [15]. Данный подход позднее был приложен к анализу данных в ферментативных методах определения креатинина [16].

Высокоспецифичные методы определения креатинина
Проблемы, связанные с невысокой специфичностью реакции Яффе, побудили к поиску более специфичных методов. Наибольший интерес представляют ферментативные или частично ферментативные методы с использованием: (1) креатининазы (КФ 3.5.4.21), также называемой креатининиминогидролазой или деиминазой, катализирующей расщепление креатинина до иона аммония и N-метилгидантоина и (2) креатинингидролазы (КФ 3.5.2.10), также называемой креатининамидогидролазой, катализирующей гидролиз креатинина до креатина (рис. 3).

В частично ферментативных, ранних вариантах автоматизированных и неавтоматизированных методов, использовали эти ферменты, или в сочетании, или раздельно. Их использовали для разрушения креатинина и определения разницы между общим количеством Яффе-реагирующих хромогенов (до добавления фермента) и остающихся в среде «некреатининовых» Яффе-реагирующих хромогенов (после добавления фермента). Данные методы позволяют оценить истинное содержание креатинина в материале.

Для определения креатинина использовали иммобилизированный фермент креатининазу в сочетании с ион-селективным электродом, чувствительным к ионам аммония. Поскольку методы, основанные на данной реакции, чувствительны как к эндогенному аммиаку и креатинину, так и к аммиаку в окружающей среде и реактивах, потребовалось введение дополнительных реакций, позволяющих вывести из реакции ионы аммония и поддерживать стабильный уровень кофермента НАДФН2 .

Был предложен полностью ферментативный метод, в котором креатинин гидролизуют до креатина, который определяют в креатинкиназной реакции (рис. 4).