Каким образом изучали структуру ПРОМОТОРА ?

- Брали ДНК

- добавляли РНК-полимеразу, которая садилась на участок ДНК

- обрабатывали ДНК-азой незащищённые РНК-полимеразой куски ДНК

- РНК-полимеразу отделяли от защищённых ею участков ДНК

эти участки изучали, как ПРОМОТОРЫ

Почему в опытах по изучению структуры ПРОМОТОРА РНК-полимераза после выполнения всех процедур никогда более не садилась на освобожденный от неё участок ДНК ?

Потому что при выполнении этих манипуляций:

- брали ДНК

- добавляли РНК-полимеразу, которая садилась на участок ДНК

- обрабатывали ДНК-азой незащищённые РНК-полимеразой куски ДНК

- РНК-полимеразу отделяли от защищённых ею участков ДНК

эти участки изучали, как ПРОМОТОРЫ

ДНК-аза экзонуклеировала на ДНК участок узнавания и первичной посадки РНК-полимеразы

Что представляет собой БОКС ПРИБНОВА на структуре ПРОМОТОРА

И за что отвечает этот функциональный участок ?

БОКС ПРИБНОВА состоит из семи нуклеотидов и отвечает за прочное связывание РНК-полимеразы и инициацию синтеза РНК

Каков состав БОКСА ПРИБНОВА ?

38 37 35 27 29 26 40 41 25 29 30 46 47

Т Т Г А Ц А .......……. Т А Т А А Т Г....Г(А)

участок, находящийся БОКС ПРИБНОВА

на расстоянии 35+2 отвечает за прочное

пар нуклеотидов связывание

левее старта начала

транскрипции и

отвечает за первичное

связывание

РНК-полимеразы

Где происходит старт инициации транскрипции ?

6-9 оснований правее инвариантного основания Т (46) БОКСА ПРИБНОВА

38 37 35 27 29 26 40 41 25 29 30 46 47

Т Т Г А Ц А .......…… Т А Т А А Т Г....Г(А)

участок узнавания Бокс ПРИБНОВА

Промоторы не транскрибируются, первым нуклеотидом в нити РНК является А или Г

Каким образом PRIBNOW (1975) установил структуру БОКСА ПРИБНОВА ?

Анализировал расшифрованные нуклеотидные последовательности

промоторов нескольких бактерий (46) и установил наиболее часто повторяющиеся нуклеотиды, которые заключил в Pribnow's box

Чем определяется скорость взаимоотношения РНК-полимеразы с ПРОМОТОРОМ ? Чем определяется эффективность ПРОМОТОРА ?

Скорость связывания РНК-полимеразы с ПРОМОТОРОМ даже у одного организма различаются (связывание РНК-полимеразы у 8-ми промоторами фага fd различается в 10 раз

Скорость взаимоотношения РНК-полимеразы с промотором определяется его ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ и СРОДСТВОМ

ЭФФЕКТИВНОСТЬ промотора определяется частотой актов инициации с данного промотора и зависит от относительной скорости образования и диссоциации комплекса фермент-ДНК, а также инициации синтеза РНК

В чём заключается особенность ПРОМОТОРОВ фагового генома ?

Преимущество фагового генома состоит в наличии чётко передаваемого сигнала СИЛЬНОГО ПРОМОТОРА, который всегда выигрывает конкуренцию между промотором бактерии и фага.

Поясните почему для проведения эксперимента по установлению полной первичной структуры ПРОМОТОРА гена тирозиновой РНК E.Coli в лаборатории Хар Джобинд КОРАНА (Har Gobind KORANA,1977) был выбран фаг Ф50 ?

Для исследований брали фаг Ф 50 благодаря двум его особенностям:

- трансдуцирует в бактерию ГЕН ТРАНСПОРТНОЙ РНК ДЛЯ ТИРОЗИНА

(ген тирРНК)

- цепи ДНК имеют разную удельную плотность

L - легкая цепь

5'------------------------------------------------------------------------------3'

3'-----ПРОМОТОР--ген транспортной тирозиновой РНК---5'

Н - тяжёлая цепь

5'--------------------------------3'

Транспортная тирозиновая РНК

Укажите основные этапы эксперимента по установлению полной

Первичной структуры ПРОМОТОРА гена тирозиновой РНК E.Coli

В лаборатории Хар Джобинд КОРАНА (Har Gobind KORANA,1977)

Для исследований брали:

L-цепь фага Ф 50

L-легкая цепь

5'------------------------------------------------------------------------------3'

3'-----ПРОМОТОР--ген транспортной тирозиновой РНК---5'

Н-тяжёлая цепь 3 ......----------------------------5'

транспортная тирозиновая РНК

5' ......----------------------------3

- цепочку из 21 нуклеотида комплементарнуюцепи

транспортной тирозиновой РНК

(очень похожая на Н-цепь) без последних 6 нуклеотидов на 3’ конце

- гибридизовал эту цепь с L-цепью ДНК фага Ф50

L-легкая цепь

5'--------------------------------------------------3'

3' ......----------------------------5'

- помещал в систему синтеза ДНК "in vitro"

- ДНК-полимераза досинтезировала в направлении 5'-3'

6 недостающих нуклеотидов и в продолжении досинтезировала структуру ПРОМОТОРА

- после чего уже изучали структуру ПРОМОТОРА

Какую форму принимают ПРОМОТОРНЫЕ ОБЛАСТИ в структуре ДНК ?

Форму палиндромов

Поясните что включает в себя стадия инициации транскрипции

ИНИЦИАЦИЯ транскрипции - образование первой фосфодиэфирной связи в цепи РНК между пурином А или Г, находящимся в форме ТРИФОСФАТА. В момент инициации происходит отщепление ПИРОФОСФАТА.

Опишите известные вам стадии инициации транскрипции

- образование первой фосфодиэфирной связи в цепи РНК между

пурином А или Г, находящимся в форме ТРИФОСФАТА

- в момент инициации происходит отщепление ПИРОФОСФАТА

- сразу после акта инициации СИГМА-ФАКТОР от РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ

отделяется и фермент, меняя при этом свою конформацию может неспецифично

транскрибировать дальше

- после отделения СИГМА-ФАКТОРА начинается стадия ЭЛОНГАЦИИ

- первый нуклеотид в нити РНК отличается от остальных тем,

что находится в ТРИФОСФАТНОЙ ФОРМЕ

- за процесс инициации ответственна бетта-субъединица и СИГМА-ФАКТОР РНК-

полимеразы

Какие стадии взаимодействия РНК-полимеразы и нуклеотидов

Происходят в процессе ИНИЦИАЦИИ ?

- присоединение начального рибонуклеозидтрифосфата к 1-ому центру РНК-

полимеразы, специализированного на воздействии с 3'-ОН группой рибозила

- присоединение второго рибонуклеозидтрифосфата к расположенному рядом

второму центру фермента (центр связывания субстрата)

- замыкание первой фосфодиэстеразной связи с отщеплением пирофосфата