Способы взятия патматериала. Методы консервирования, упаковки и транспортировки патматериала. Сопроводительная документация.

Отбор материала.

Материал берут с учётом клинических признаков болезни, которые указывают на поражение той или иной системы, патологоанатомической картины при вскрытии (изменения в различных органах - печени, лёгких, кишечнике и т. д.), а также основываясь на предполагаемом диагнозе, поскольку для каждой инфекции характерна определенная локализация возбудителя в организме.

Материал для исследования берут прижизненно или посмертно (от павших или вынужденно убитых животных). Во всех случаях желательно брать материал от животных, не подвергавшихся лечению антибиотиками, и в максимально короткие после их гибели сроки, так как через 2-3 часа после смерти нормальная микрофлора начинает проникать в органы и ткани. Что затрудняет выделение возбудителя в виде чистой культуры. Чтобы избежать контаминации посторонней микрофлорой, исследуемый материал берут стерильно с использованием стерильного инструмента и посуды для транспортировки.

Трупы мелких животных, а также небольшие трупы павших поросят, ягнят, телят и других мелких животных лучше посылать в лабораторию целиком в непроницаемой таре.

Паренхиматозные органы и их фрагменты (у крупных животных) берут, соблюдая требования асептики. Каждый орган (фрагмент) помещают в стерильную посуду, транспортируют в нативном виде или консервируют одним из способов.

Трубчатые кости посылают на исследование целыми, с неповрежденными концами и тщательно очищенными от мышц и сухожилий. Кости завёртывают в марлю или полотно, хорошо смоченные дезинфицирующей жидкостью (5%-ным раствором карболовой кислоты или фенола). Кости можно также посыпать поваренной солью и завернуть в полотно или марлю.

Гной, пунктаты органов, экссудат берут при помощи стерильного ватного тампона, шприца. При взятии содержимого пиром (бурс) в области поражения выстригают шерсть, кожный покров дезинфицируют 70° спиртом и смазывают настойкой йода. Затем стерильным шприцем с иглой большого диаметра делают пункцию, отсасывают содержимое гигромы и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Кровь рекомендуют брать при лихорадочных состояниях стерильным шприцем в количестве 15-20 мл. Кровь, а также другие жидкие материалы, можно отбирать стерильной пастеровской пипеткой с последующим запаиванием её кончика.

Кровь, гной, выделения из различных полостей, естественных отверстий и др. можно посылать для микроскопического исследования в виде мазков. Кровь у животных берут из вены ушной раковины или края верхушки уха, у птиц - с поверхности гребня или подкрыльцовой вены. Шерсть на месте взятия крови выстригают или выбривают, кожу тщательно протирают ватными тампонами, смоченными сначала спиртом, а затем эфиром.

Инструменты (иглы, скальпель) должны быть стерильными. Первую каплю удаляют стерильной ватой, (исключение делают при исследовании крови на гемоспоридиозы), а следующую свободно выступившую каплю крови берут быстрым и легким прикосновением к ней поверхностью предметного стекла. Затем стекло быстро поворачивают вверх каплей и удерживают между пальцами левой руки в горизонтальном положении. К левому краю капли прикасаются под углом 45° шлифованным краем другого предметного (или покровного) стекла. Как только капля равномерно распределится по ребру этого стекла, им быстро проводят по поверхности предметного стекла слева направо, не доводя до края на 0,5-1,0 см. Ширина мазков должна быть уже предметного стекла. Для каждого нового мазка берут свежую каплю крови. Готовые мазки крови высушивают на воздухе. Не рекомендуется подсушивать их над пламенем или на солнце.

Правильно приготовленные мазки крови должны быть тонкими, равномерными и достаточной длины. На высушенных мазках и отпечатках острым предметом надписывают номер или кличку животного и дату приготовления.

Мазки из тканей, гноя, органов и различных выделений готовят путем размазывания материала на предметном стекле стерильной палочкой или ребром другого предметного стекла до тонкого слоя. Частицы органов плотной консистенции, твердые узелки, а также вязкий материал целесообразно заключить между двумя предметными стеклами. Их разъединяют после растирания помещённого между ними материала стекла в противоположные стороны в горизонтальном направлении, в результате чего получают два довольно тонких мажа. Иногда получают так называемые препараты-отпечатки. Для этого вырезанный острым скальпелем кусочек органа захватывают пинцетом и свободной поверхностью кусочка делают на стекле несколько тонких отпечатков.

Моча: наружные половые органы обмывают, ополаскивают стерильным физиологическим раствором, осушают стерильным марлевым тампоном. Первую порцию мочи не берут, последующую в необходимом количестве набирают в стерильную посуду.

Мокрота: собирают до приема корма. Из трахеи берут при помощи стерильного трахеотубуса и стерильного ватного тампона на проволоке. При глубоком (до бифуркации) введении тампона возникает кашель, и удаётся получить бронхиальную слизь. Тампон с материалом помещают в пробирку со стерильным раствором. При взятии материала из носоглотки используют специальные приборы, носоглоточные тампоны на изогнутой проволоке, носовые ватно-марлевые тампоны.

Секрет молочной железы: сосок обмывают водой, обрабатывают 70˚ этанолом, ополаскивают стерильным физиологическим раствором. Первую порцию секрета сцеживают и удаляют. Из каждой доли вымени берут последние порции молока по 10-15 мл в отдельные стерильные пробирки с резиновыми пробками. У овец и коз пробы молока берут путём пункции цистерны вымени. Для этого животное фиксируют в боковом положении, вымя у основания соска протирают 70° спиртом и смазывают настойкой йода. Стерильным шприцем с иглой делают пункцию у основания соска, и после попадания иглы в цистерну (о чем судят по свободному движению конца иглы) набирают в шприц молоко и переносят его в стерильную пробирку с резиновой пробкой.

Спинномозговая жидкость: обычно берут при наличии менингоэнцефалитического синдрома путем пункции.

Кишечник: если исследуют содержимое кишечника, то пересылают отдельные отрезки кишечника, перевязанные на концах лигатурами. В остальных случаях интересующие отрезки кишечника освобождают от содержимого, промывают стерильной водой и помещают в банку со стерильным 30%-м водным раствором глицерина или насыщенным раствором хлорида натрия. Объем консервирующей жидкости должен превышать объем взятого материала в 4-5 раз. Кишечник отправляют в лабораторию вместе с регионарными лимфатическими узлами.

Фекалии берут стерильными ватными или ватно-марлевыми ректальными тампонами, которые вводят на 8-10 см в прямую кишку, а затем помещают в стерильную пробирку. Если нет возможности сразу сделать посев, используют консервирующие смеси. В противном случае нарушается исходное количественное соотношение микробных видов, и размножение некоторых бактерий может привести к инактивации искомого возбудителя. От трупов животных кал можно послать в отрезке невскрытого кишечника, завязанного с обоих концов. Кал в лабораторию должен быть доставлен не позднее 24 часов после его взятия.

Кожа. Для исследования участков кожи берут наиболее пораженные кусочки её размером 10x10 см и посылают в стерильной, герметически закупоренной посуде.

Кровь для серологического исследования у КРС, овец, лошадей, верблюдов, оленей, овец и коз берут из ярёмной вены в верхней трети шеи в стерильные бактериологические пробирки, у свиней - из хвостовой, передней краниальной вен или глазного синуса, у птиц - из подкрыльцовой вены, у кроликов - из краевой ушной вены, кровь у лисиц и песцов берут из бедренной вены; у норок - путём отсечения подушечки среднего пальца задней лапы или кончика хвоста.

Иглы перед взятием крови обязательно стерилизуют кипячением. Шерсть на месте взятия крови тщательно выстригают, а кожу дезинфицируют спиртом или эфиром, можно и 3%-ным раствором карболовой кислоты. Нужно следить, чтобы кровь стекала в пробирку струей, а не каплями. Кровь, взятая каплями и вспененная, скорее гемолизируется и часто даёт неправильные результаты при исследовании. Не следует допускать, чтобы кровь попадала на землю. Для этого надо пользоваться баночкой с дезинфицирующей жидкостью, куда опускают первую порцию крови.

Брать кровь для получения сыворотки надо по возможности утром, до кормления животных. Для серологического исследования берут по 7-10 мл крови от крупного рогатого скота, лошадей, овец, свиней; от пушных зверей и птиц - по 112 мл.

Сыворотку крови получают методом отстоя. Для этого пробирки с кровью необходимо выдержать до формирования сгустка в тепле (1,5-2 ч), затем для отделения от стенок пробирки обвести сгусток чистой стеклянной палочкой или спицей. Для отстаивания сыворотки пробирки с кровью помещают в холодильник при 4-6˚С на 18-20 ч. После ретракции сгустка сыворотку крови переливают в серологические пробирки с резиновыми пробками. При необходимости сыворотку крови консервируют, добавляя в пробирку несколько крупинок борной кислоты, тиомерсал (конечное разведение 1:10000), 5%-й фенол (1 капля на 1 мл сыворотки при постоянном помешивании) или замораживают. При необходимости сыворотки можно высушивать. Делается это следующим образом. Сыворотку (0,4 мл) наносят на фильтровальную бумагу (5x5 см) и выдерживают при рассеянном свете до полного высыхания. На каждом листе с сывороткой делают соответствующие записи простым карандашом, завёртывают в пергаментную бумагу (каждую пробу отдельно), упаковывают в конверт и в таком виде отсылают в лабораторию, где каждую пробу сухой сыворотки помещают в пробирку с 2 мл физраствора. Термостатируют 6-10 часов или выдерживают при комнатной температуре 24 часа, а затем исследуют. Сухие сыворотки сохраняют антигенные свойства 40-130 дней. Сыворотки, консервированные фенолом или борной кислотой, пригодны для исследования в течение 30 дней; замороженные сыворотки - в течение 3 дней после однократного оттаивания. Мутные, проросшие, гемолизированные сыворотки исследованию не подлежат. На каждой пробе сыворотки указывают её номер или кличку животного, или фамилию владельца животного. Пробы направляют с описью в двух экземплярах.

Консервирование, транспортировка и хранение материала. Материал помещают в стерильную стеклянную посуду (пробирки, флаконы, банки и т. д.), закупоривают.

При подозрении на особо опасные инфекции сосуды с материалом помещают в герметичный металлический пенал, который опечатывают.

Транспортировку и хранение материала до исследования проводят таким образом, чтобы предотвратить размножение сопутствующей микрофлоры и инактивацию искомого микроорганизма. С этой целью исследуемый материал (кусочки органов) помещают в стерильную смесь равных объемов глицерина и физиологического раствора и помещают в термос, содержащий: 1) снег или лёд и поваренную соль (в соотношении 3:1), температура смеси -15 - -20˚С; 2) равные части сухого льда и этанола, температура смеси около -70˚С.

Для консервирования материала, содержащего энтеробактерии. Используют смеси, в которых исследуемый материал должен составлять 1/3 общего объема.

Глицериновая смесь: глицерин - 500 мл, физиологический раствор - 1000 мл, рН смеси доводят до 7,8-8,0 добавлением 20%-ного раствора гидрофосфата калия. Смесь стерилизуют дробно, текучим паром.

Фосфатная буферная смесь: дистиллированная вода - 1000 мл, дигидрофосфат калия - 0,45 г, гидрофосфат калия - 5,34 г. Стерилизуют при 121˚С 20 минут.

Для энтеробактерий используют также накопительные среды (селенитовая, магниевая, желчный бульон), которые должны составлять 4/5 общего объема. Независимо от способа консервирования фекалии транспортируют и сохраняют до посева при 2-6 ˚С.

Трупы мелких животных, части трупов животных и отдельные органы в свежем (нефиксированном) виде отправляют для исследования в лабораторию только с нарочным. Посылаемый материал, особенно от животных, подозрительных по заболеванию инфекционной болезнью, должен быть тщательно упакован в плотный деревянный или металлический ящик, чтобы предупредить возможность рассеивания инфекции в пути. Перед упаковкой материал необходимо завернуть в ткань или мешковину, смоченную дезинфицирующим раствором (фенольный креолин, известковое молоко), и плотно уложить в ящик, чтобы не болтался при пересылке почтой стеклянной посуды, в которой заключён посылочный материал с подозрением на наличие опасных болезней (сап, сибирская язва, эмфизематозный карбункул, бруцеллез, туляремия, перипневмония крупного рогатого скота, чума крупного рогатого скота, чума свиней, псевдочума птиц, ящур, бешенство), обязательно упаковывают в металлическую коробку, которую запаивают, пломбируют или опечатывают, а затем упаковывают в деревянный ящик.

На лицевой стороне посылки вверху должна быть надпись «Осторожно - стекло» и «Верх».Если такой материал доставляют с нарочным, можно отправлять его в стеклянной, герметически закупоренной посуде, без металлической коробки, но в ящике.

На взятый патологический материал составляют сопроводительный документ. Если при вскрытии посылки в лаборатории будут установлены несоответствие сопроводительному документу или порча патологического материала, то обязательно составляют акт, копию которого отправляют ветеринарному врачу, направившему материал в лабораторию.

В сопроводительном документе указывают: название и адрес хозяйства, фамилию ветеринарного работника, направляющего материал, вид животного, от которого материал получен, характер материала, на какую инфекцию необходимо исследовать. Кроме того, прилагают протокол патологоанатомического вскрытия и описание клинико-эпизоотологических данных.

Поступивший в лабораторию неконсервированный материал можно хранить при температуре 4˚С 1-2 суток; консервированный в 50%-ном растворе глицерина (кусочки органов) - несколько недель; для длительного хранения материал замораживают при -15 - -20˚С.

Взятие проб воды, почвы, кормов, шерсти.

Пробы почвы отбирают почвенным буром. Обследуемую площадь разбивают на участки размером не более 16 м2. Пробы почвы с территории, подозреваемой в поверхностном обсеменении сибиреязвенным возбудителем, берут на глубину до 15 см. На территории скотомогильников сначала снимают на 2-3 см верхний слой почвы, а затем берут пробы на глубину до 2 м через каждые 25 см.

Вынутую из глубины и не использованную для проб почву (3 части) обеззараживают сухой хлорной известью (1 часть), содержащей 25% активного хлора. Если почва сухая, её слегка увлажняют. Место отбора проб также дезинфицируют раствором хлорной извести (5% активного хлора), инструменты - огнём паяльной лампы.

Пробы воды отбирают барометром или специально приспособленной бутылью. Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут на глубине 10-15 см и у дна. Пробы придонного осадка - у береговой кромки и исследуют их так же, как и пробы почвы. Объем каждой пробы - не менее 0,5 л, общий объем - не менее 1 л.

Перед взятием проб из водопровода кран обжигают горящим спиртовым тампоном. Открыв кран, набирают в стерильную посуду 0,5 л воды, затем в течение 10 минут спускают воду и берут еще 0,5 л в другую стерильную посуду. Первичные пробы грубых кормов берут из разных мест при помощи ножниц и пинцета. С 4 м2 площади берут 1 пробу сухого корма массой не менее 40 г, зеленой массы - до 100 г.

Корнеплоды и клубни берут 1-3 штуки на 4 м2 площади бурта, отсека. С отобранных корнеплодов срезают поверхностный слой в местах, где имеются остатки земли.

Пробы силоса, хранящегося в ямах (траншеях), отбирают так же, как и пробы почвы, а вынутого из траншеи, как пробы зелёной массы. В лабораторию направляют среднюю пробу, которую составляют из хорошо перемешанных первичных проб данной партии, ёмкости и т. п. Масса средней пробы должна быть не более 500 г.

Отбирают пробы концентрированных кормов сухим стерильным пробным щупом. После взятия проб от каждого объекта (партии) щуп очищают и дезинфицируют огнём паяльной лампы. От незатаренных кормов первичные пробы отбирают из расчёта 1 проба (не менее 100 г) на 4 м2 поверхности. Берут не менее 5 проб от каждого закрома, партии. Первичные пробы берут из поверхностных и глубоких слоёв корма равномерно по всей площади.

Отдельно берут образцы корма из тех мест, откуда скармливали животным перед заболеванием, а также из остатков, находящихся в помещении и в кормушках. Отобранные средние образцы кормов отдельно заворачивают в бумагу, перевязывают шпагатом и надписывают.

Если шерсть упакована в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также пыль, скопившуюся внутри обшивки. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.

Каждую отобранную пробу помещают в сухую стерильную стеклянную банку и закрывают стерильной крышкой, пробкой или пергаментом. Можно использовать полиэтиленовые мешочки, которые завязывают шпагатом. Пробы воды наливают в стерильные стеклянные бутылки и закрывают стерильными резиновыми пробками. Пробы нумеруют (пробы шерсти - номером кипы), упаковывают во влагонепроницаемую тару и направляют в лабораторию с нарочным.

В сопроводительной записке к пробам указывают причину проведения исследования, какой материал, в каком количестве направляют, место и дату отбора материала, для проб шерсти и кормов дополнительно указывают их происхождение, объем (массу) партии, вид упаковки и количество упаковочных единиц.

При направлении в лабораторию нескольких проб почвы, шерсти и т. п. к сопроводительной прилагают опись с указанием номерка проб и места их отбора.

Отбор и упаковку проб проводят с соблюдением мер личной профилактики и общепринятых в бактериологической практике правил стерильности, не допуская рассеивания возбудителя при отборе и транспортировке проб.

При подозрении на бруцеллез на бактериологическое исследование направляют абортированный плод с плодными оболочками или желудок плода с содержимым (желудок перевязывают со стороны пищевода и двенадцатиперстной кишки), а также кусочки печени и селезёнки. От свиноматок берут не менее 3 плодов.

Посылают стерильно взятые пробы молока (последние порции), содержимое тигром (бурс).

Для исследования на инфекционный эпидидимит в лабораторию направляют от баранов - семенники с придатками; от овцематок - абортированные плоды с плодными оболочками, выделения из половых путей, взятые в первые 5 дней после аборта.

От абортированного животного одновременно с патологическим материалом направляют кровь для серологического исследования. Если в течение 24-30 часов материал доставить в лабораторию невозможно, его консервируют 30%-ным раствором глицерина. Крупные плоды направляют в неконсервированном виде.

От животных, убитых с диагностической целью, направляют паренхиматозные и половые органы, а также паховые, подвздошные, предлопаточные, заглоточные, подчелюстные или мезентеральные лимфатические узлы, манку, трубчатую кость. Если узлы парные, то направляют правый и левый.

На серологическое исследование в лабораторию направляют кровь (или сыворотку крови) и молоко.

Для исследования на бруцеллез в кольцевой реакции пробу (10-15 мл) цельного свежего молока берут из одного удоя в стерильную пробирку. Молоко должно быть доставлено в лабораторию и исследовано в день взятия пробы. Если это невозможно, его консервируют сухой борной кислотой (0,1 г на 10 мл) или генцианвиолетом (0,4 мл 1%-ного спиртово-водного раствора краски на 10 мл молока). Консервированное молоко пригодно для исследования в течение 10 дней. Пробы молока на рынках берут из каждой отдельной посуды (бидон, фляга и пр.) после тщательного его перемешивания. При массовом исследовании молока отбирать пробы и ставить кольцевую реакцию необходимо на ферме в специально отведенном помещении. Не разрешается исследовать в кольцевой реакции молоко от животных, страдающих маститом или болезнями, сопровождающимися лихорадкой, а также молоко животных в первые две недели после родов.

Стерилизация лабораторной посуды.

Стерилизация - обеспложивание; уничтожение в каком-либо материале патогенных и непатогенных микроорганизмов в вегетативной и споровой формах.

Подготовка посуды для стерилизации. Лабораторная посуда должна быть чисто вымытой и простерилизованной. Для мытья используют растворы мыла или химические моющие средства. Новую посуду предварительно кипятят в 1-2%-м растворе соляной кислоты, во избежание последующего выщелачивания стекла. Вымытую в проточной воде посуду ополаскивают дистиллированной водой и высушивают.

Бактериологические пробирки. Конические, матровые колбы закрывают ватно-марлевыми пробками, состоящими из плотно скрученных валиков ваты, покрытых слоем марли. Для бактериологических пробирок также разработаны металлические пробки в виде наружных колпачков. Следует учитывать, что стерилизация ватных пробок при высокой температуре приводит к выделению из ваты веществ, ингибирующих рост некоторых чувствительных бактерий, например бруцелл.

При монтаже пипеток в верхний конец вставляют ватный тампон. У пипеток Пастера должен быть запаян капилляр. Каждую мерную пипетку заворачивают длинной полоской бумаги шириной 4-5 см, начиная с носика, винтообразно по всей длине. Пипетки Пастера заворачивают в бумагу по 10-20 штук, пробирки - по 15-20 штук. Все виды пипеток лучше хранить до и после стерилизации в специальных металлических пеналах. Пробки на колбах дополнительно покрывают колпачками из бумаги.

Чистые чашки Петри в собранном виде перед стерилизацией заворачивают в бумагу по 3-4 штуки. После стерилизации бумага предохраняет стерильную посуду от загрязнения микрофлорой.

Посуду перед стерилизацией размещают в сушильном шкафу не слишком плотно, чтобы обеспечить циркуляцию воздуха, и следят, чтобы температура не превышала 180˚С, так как при более высокой температуре бумага и вата будут обугливаться. После окончания стерилизации сушильный шкаф не открывают до тех пор. Пока температура в нём не снизится до 70-80˚С, поскольку резкий перепад температур может привести к разрушению стекла.

Если посуда предназначена для стерилизации в ней питательных сред автоклавированием под давлением не менее 1 атм, то ее предварительно не стерилизуют. При стерилизации сред текучим паром или в автоклаве под давлением не более 0,5 атм необходимо использовать стерильную посуду.

Стерилизация сухим нагретым воздухом. Метод применяют для стерилизации чистой стеклянной посуды. Для этого используют печь Пастера - специальный сушильный шкаф с двойными стенками. Снаружи он облицован теплонепроницаемым материалом. В верхней его части находится термометр. Между теплонепроницаемой обшивкой и внутренним металлическим корпусом на дне помещен автоматический электронагревательный элемент. При включении сушильного шкафа в электросеть воздух внутри него нагревается. По достижении заданной температуры отмечают время начала стерилизации. Режим стерилизации: при температуре 155-160˚С - экспозиция 2 часа, при 165-170˚С - 1-1,5 ч, при 180˚С - 1 часа. По истечении времени стерилизации нагревание прекращают.

Автоклавирование. Это стерилизация паром под давлением в сочетании с высокой температурой в специальном аппарате - автоклаве. При встрече насыщенного пара с более холодным объектом пар конденсируется, превращаясь в воду, в результате чего выделяется большое количество тепла. Кроме того, уменьшается объем пара, что способствует его проникновению во внутренние части стерилизуемого материала. Обязательное условие - поступление действительно насыщенного пара, чтобы его соприкосновение с холодным предметом вело к немедленной конденсации и нагреванию. Промышленность выпускает вертикальные и горизонтальные автоклавы.

Вертикальный автоклав - это двустенный металлический котел цилиндрической формы, закрываемый герметично крышкой. Между стенками через специальный кран с воронкой заливают воду до определенного уровня. Внутренняя стенка котла в верхней части снабжена отверстиями, в нижней - краном, через который при нагревании воды пар вытесняет воздух из котла. Сверху на автоклав надевают металлический защитный каркас, причём между ним и самим автоклавом должно быть свободное пространство. Автоклав нагревают включением в электросеть.

Автоклав загружают стерилизуемым материалом, закрывают крышку и кран, через который заливали воду, нижний кран временно оставляют открытым. Нагреваемая вода между стенками автоклава кипит, образующийся пар поднимается вверх и через верхние отверстия внутренней стенки проходит внутрь котла, толчками вытесняя воздух через нижний открытый кран. Когда воздух весь вытеснен, и пар начинает выходить ровной струей, нижний кран закрывают. В результате давление пара внутри автоклава повышается. Началом стерилизации считают момент, когда давление достигает заданной величины (по показателям манометра). Нагрев регулируют на протяжении всей стерилизации, поддерживая давление пара на одном уровне. При чрезмерном повышении давления внутри автоклава предусмотрен предохранительный клапан, через который избыток пара автоматически выходит наружу. При повышении давления пара соответственно повышается и температура в автоклаве. Манометр показывает давление пара без учета окружающего атмосферного давления (760 мм рт. ст.). По истечении времени стерилизации автоклав отключают. После остывания при нулевом показании манометра открывают кран для спуска пара.

Горизонтальный автоклав отличается от вертикального конструкцией, но принцип действия у него такой же.