Главная Случайная страница


Категории:

ДомЗдоровьеЗоологияИнформатикаИскусствоИскусствоКомпьютерыКулинарияМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОбразованиеПедагогикаПитомцыПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРазноеРелигияСоциологияСпортСтатистикаТранспортФизикаФилософияФинансыХимияХоббиЭкологияЭкономикаЭлектроника






Газохроматографический анализ моносахаридов

Цель работы: Определить качественный и количественный состав гидролизатов или изолированных моносахаридов.

В гидролизатах происходит мутаротация моносахаридов, т.е. образование равновесной смеси таутомерных форм: а-, (3-пиранозных, а-, β-фуранозных и открытой (альдегидной). Для глюкозы это иллюстрирует следующая схема:

 

Рис. 1.11. Схема образования таутомерных форм глюкозы

 

Существование таутомерных форм затрудняет определение состава моносахаридов в гидролизате.

Моносахариды нелетучи и непосредственное разделение их смесей методом газожидкостной хроматографии невозможно. Сахара могут быть хроматографически разделены в виде летучих производных – простых и сложных эфиров. Широко распространен метод анализа в виде триметилсилильных (ТМС) производных моносахаридов. Последние являются летучими гликозидами простых О-триметилсилиловых эфиров углеводов, образующихся в результате полного замещения гидроксильных групп моносахаридов при их силилировании.

В качестве силирующего реагента моносахаридов используют смесь триметилхлорсилана и гексаметилдисилазана в среде пиридина. В качестве примера приводится схема силирования для β-D-глюкозы:

Подобным образом синтезируются ТМС-производные других моносахаридов. При этом устанавливается новая равновесная смесь, в которой преобладают пиранозные формы. Соотношение таутомеров в зависимости от условий колеблется. Состав ТМС-производных таутомерных форм индивидуальных моносахаридов приведен ниже.

Таблица 1.4.

Состав ТМС-производных таутомерных форм индивидуальных моносахаридов

Таутомерные формы моносахаридов Массовая доля, %
L-Арабиноза
α-Арабинопираноза 51,6
β-Арабинопираноза 40,1
Арабинофураноза 8,3
D- Ксилоза
α-Ксилопираноза 40,2
β-Ксилопираноза 56,2
Ксилофураноза 3,6
D-Манноза
α-Маннопираноза 72,8
β-Маннопираноза 27,2
D-Галактоза
α -Галактопираноза 29,9
β-Галактопираноза 45,8
Галактофураноза 24,3
D-Глюкоза
α-Глюкопираноза 47,3
β-Глюкопираноза 49,5
Глюкофураноза 3,2

Для уменьшения числа пиков на хроматограмме и упрощения ее обработки моносахариды восстанавливают до соответствующих многоатомных спиртов (полиолов) с последующим их превращением в ацетаты. Каждый полиол даст на хроматограмме один пик, поскольку таутомерия у полиолов невозможна.

При анализе ТМС-производных методом газожидкостной хроматографии используют в качестве газа-носителя азот или гелий. В качестве жидкой фазы используют различные силиконовые масла и полиэфиры. Наиболее селективными фазами из вырабатываемых отечественной промышленностью являются неполярное метилхлорсиликоновое масло и полярный политриэтиленгликольсебацинат.

Рис. 1.12. - Хроматограмма модельной смеси ТМС производных моносахаридов: 1 - β-L-арабиноза; 2 - γ-D-ксилоза; 3 - α-L-арабиноза; 4 - γ-L-арабиноза; 5 -α-D-ксилоза; 6 - β-D-ксилоза; 7 -α-D-манноза; 8 - γ-D-галактоза; 9 - α-D-галактоза; 10 - β-D-манноза; 11 - α-D-глюкоза + β-D-галактоза; 12 - сорбит; 13 - β-D-глюкоза
Для хроматографического разделения смеси летучих производных моносахаридов используют ДИП. В соответствии с tR на хроматограмме в определенном порядке появляются пики индивидуальных соединений. Порядок выхода при хроматографическом разделении ТМС-производных зависит от жидкой фазы. Его устанавливают предварительно для данной фазы с использованием модельных ТМС-произ-водных чистых моносахаридов по их времени удерживания. В качестве примера на рис. 1.12 приведена хроматограмма модельной смеси, разделенной на колонке с метилхлорфенилсиликоновым маслом в качестве жидкой фазы.

Характеристики удерживания ТМС-производных Сахаров при хроматографии в следующих условиях: колонка из стали; длина - 3 м; диаметр - 3 мм; твердый носитель - хромосорб (120/140 меш); НЖФ — полиметилфенилсиликоновая жидкость (НМФМ-6); температура колонки - 170°С; изотермический режим; газ-носитель - гелий; расход газа - 60 мл/мин; температура испарения - 250°С - приведены в таблице 1.5.

Таблица 1.5.

Время удерживания ТМС-производных tR

Компонент tR Компонент tR
β-L-Арабиноза 7'48" γ-D-Галактоза 20'54"
α-D-Ксилоза 8'48" a-D-Галактоза 23'00"
α-L-Арабиноза 9'24" β-D-Манноза 25'42"
γ-D-Арабиноза 10'42" α-D-Глюкоза 27'24"
γ-D-Ксилоза 12'30" β-D-Галактоза 28'12"
β-D-Ксилоза 15'30" Сорбит 33'30"
α-D-Манноза 17'30" β-D-Глюкоза 40'30"

Существует несколько методов количественного определения состава смеси по полученным хроматограммам. По первому методу определяют площади пиков всех таутомеров каждого моносахарида расчетом площади треугольной аппроксимацией пика – умножением основания пика на половину высоты. При частичном наложении пиков друг на друга и невозможности прямого измерения основания площадь пика определяют умножением его высоты на ширину, измеренную на половине высоты. Возможно, также определять долю каждого пика его переносом на бумагу и взвешиванием вырезанного из нее пика на аналитических весах, относя найденную массу к массе всех анализируемых пиков. Результат выражают в процентах, используя метод нормировки площадей.

По второму методу количественное определение массовой доли конкретного моносахарида в смеси производят по площади пика одного из его таутомеров, исходя из условия, что при синтезе ТМС-производных в строго постоянных условиях соотношение таутомеров сохраняется постоянным. Это позволяет для расчета выбрать наиболее разрешенный пик, называемый характеристическим. В качестве таких пиков обычно используют пики ТМС-производных β-L-арабинопиранозы, β-D-ксилопиранозы, α-D-маннопиранозы, α-D-галактопиранозы и β-D-глюкопиранозы. Площади пиков остальных таутомеров непосредственно не измеряют, а находят расчетом. С учетом доли характеристического пика вычисляют общую площадь пиков всех таутомеров данного моносахарида. Количественное соотношение таутомерных форм необходимо устанавливать для данных условий хроматографирования и при их изменении определение следуют проводить вновь. Долю конкретного моносахарида находят отнесением площади всех пиков данного моносахарида к общей площади всех пиков.

Количественное определение массы индивидуальных моносахаридов производят с использованием внутреннего стандарта (сорбита). Масса сорбита, добавляемая в анализируемую смесь, должна обеспечить его концентрацию в растворе, примерно соответствующую концентрации индивидуальных моносахаридов. Расчет ведут по градуировочному графику. График получают, по данным хроматографирования эталонных растворов, содержащих индивидуальный моносахарид и сорбит. Градуи-ровочный график строят в координатах: по оси абсцисс — масса чистого моносахарида в эталонном растворе, по оси ординат — отношение площади характеристического пика этого же моносахарида к площади пика внутреннего стандарта. График имеет линейную форму. Прямую линию проводят с использованием метода наименьших квадратов.

Относительная ошибка определений cахаров в гидролизате зависит от их массовой доли в анализируемой смеси и составляет 1—5%. Общее время анализа при серийном проведении определений около 2 ч, не считая времени на получение градуировочных графиков.

Анализ гидролизатов методом газожидкостной хроматографии включает подготовку гидролизатов к анализу, синтез ТМС-производных моносахаридов, хроматографическое разделение этих производных и обработку хроматограмм.

Подготовка гидролизатов к анализу

Гидролизаты, полученные при обработке древесины концентрированной серной кислотой, нейтрализуют карбонатом бария до рН 5 (по универсальной индикаторной бумаге). Раствор отфильтровывают через конусообразную стеклянную воронку с бумажным фильтром от осадка сульфата бария. Гидролизаты, полученные при обработке древесины соляной кислотой, нейтрализуют карбонатом, натрия до рН 5.

Синтез ТМС-производных моносахаридов

В круглодонную колбу вместимостью 50 см3 вносят пипеткой пробу нейтрализованного и упаренного гидролизата, содержащего около 20 мг РВ. В случае изолированных cахаров используют пробу (нейтрализат), содержащую 0,02 г углеводов, и выпаривают досуха.

Работу выполняют в двух вариантах — с внутренним стандартом (сорбитом) или без него.

Раствор сорбита вносят в колбу пипеткой в объеме, соответствующем его массе, равной 2-5 мг. Колбу присоединяют к ротационному вакуумному испарителю и выпаривают раствор при температуре 40-42°С и остаточном давлении 0,5-1 кПа. Выпаривание производят досуха (в течение 5-10 мин). Для удаления следов воды к упаренной пробе добавляют 2-3 раза по 1 см3 спиртотолуольной смеси (4:1), которую также удаляют упариванием. Затем сухой остаток в этой же колбе растворяют в 2 см3 свежеперегнанного сухого пиридина, добавляют 0,6 см3 гексаме-тилдисилазана и 0,3 см3 триметилхлорсилана. Колбу закрывают пробкой, энергично встряхивают 30 с и при комнатной температуре выдерживают реакционную смесь в течение 10 мин.

Если анализируемая проба плохо растворяется, колбу нагревают на водяной бане при температуре 75-85°С в течение 2-3 мин. Затем проводят упаривание пиридина из реакционной смеси на ротационном испа­рителе при температуре 40°С и остаточном давлении 0,5-1 кПа в течение 10 мин. Остаток растворяют в этой же колбе в 2 см3 н-гексана. В хорошо закрытых колбах ТМС-производные устойчивы в течение нескольких недель.

Хроматографическое разделение ТМС-производных

Разделение производят с использованием хроматографов. Подготовка и работа на приборе выполняется в соответствии с инструкцией, прилагаемой к прибору. Температура изотермического режима работы колонки составляет 150°С, расход газа-носителя (азота) — 60 см3/мин, продолжительность хроматографического разделения 30-40 мин.

В качестве жидкой фазы можно использовать метилхлорсили-коновое масло ХС-2-1 (3% массы твердого носителя) или полиэтиленгли-кольсебацинат (10%). Пригодны также и другие жидкие фазы.

Обработка данных

Записанная на диаграммной ленте хроматограмма включает пики всех содержащихся в пробе гидролизата таутомеров моносахаридов. Проводят идентификацию пиков, пользуясь ранее установленными для данных условий хроматографирования значениями времени удерживания tR таутомерных форм моносахаридов (см. ниже).

При первом варианте анализа (с внутренним стандартом) вычисляют площади пика стандарта и характеристического пика для каждого моносахарида умножением высоты пика на его ширину, измеренную на половине высоты.

Рассчитывают отношение площадей каждого характеристического пика моносахарида к площади пика внутреннего стандарта (Si/Sст). По этим соотношениям с помощью градуировочного графика находят массу каждого моносахарида в пробе гидролизата.

Массовую долю каждого моносахарида в гидролизате, %, рассчитывают по формуле:

(1.34)

где mi – масса моносахарида в пробе гидролизата, мг; V – объем пробы гидролизата, см3.

По полученным значениям с, для гидролизатов легко- и трудно-гидролизуемых полисахаридов рассчитывают массовые доли соответствующих полисахаридов в процентах по отношению к абсолютно сухой древесине.

По второму варианту рассчитывают долю каждого моносахарида в процентах от их общей массы по методу нормировки площадей. Вычисляют площади пика стандарта и характеристического пика для каждого моносахарида умножением высоты пика на его ширину, измеренную на половине высоты.

Рассчитывают отношение площадей каждого характеристического пика моносахарида к площади пика внутреннего стандарта (Si/Sст). По этим соотношениям с помощью градуировочного графика находят массу каждого моносахарида в пробе гидролизата.

Массовую долю каждого моносахарида в гидролизате, %, рассчитывают по формуле:

(1.35)

Определение времени удерживания моносахаридов и построение градуировочных графиков

По первому варианту анализа (с внутренним стандартом) готовят эталонные растворы определенной концентрации чистых моносахаридов и внутреннего стандарта – сорбита. Для каждого моносахарида готовят пять эталонных растворов концентрацией от 2 до 10 мг/см3. Концентрация раствора сорбита постоянна — 4 мг/см3. Из каждого раствора отбирают три пробы, синтезируют ТМС-произродные и хроматографируют, как указано выше. На каждой из трех хроматограмм для каждого пика фиксируют значение вычисляют площадь характеристического пика таутомера моносахарида Si и площадь пика сорбита Sст. Таким образом, находят Si / Sст для всех пяти эталонных растворов. По средним значениям результатов трех параллельных анализов для каждого из пяти эталон­ных растворов строят графики зависимости отношений Si / Sст от массы моносахаридов, пользуясь методом наименьших квадратов.

Время удерживания для каждого моносахарида находят по шкале времени хроматограмм.

По второму варианту анализа для каждого моносахарида готовят по одному эталонному раствору чистых моносахаридов концентрацией 4–6 мг/см3, синтезируют ТМС-производные и хроматографируют пробы (три параллельных определения) в условиях, соответствующих методике анализа, и определяют tR.

Примечания:

При подготовке гидролизатов вместо нейтрализации для удаления кислоты можно применять аниониты.

Объем пробы гидролизата можно уменьшить так, чтобы масса РВ в ней составляла около 10 мг, и анализ проводить в пенициллиновой баночке.

Для получения более точных результатов рекомендуется раствор пробы упаренного гидролизата в пиридине выдерживать в течение суток для установления устойчивого равновесия между таутомерными формами моносахаридов. Время выдерживания можно сократить до 2 ч добавлением к пиридину 0,2% перхлората лития LiClО42О.

 

Лабораторная работа №9

Последнее изменение этой страницы: 2016-07-23

lectmania.ru. Все права принадлежат авторам данных материалов. В случае нарушения авторского права напишите нам сюда...