РАЗДЕЛ 3. Капиллярный электрофорез

Введение

С начала 80-х годов XX века получил становление и активное развитие новый инструментальный метод, относящийся к комбинированным методам разделения и анализа - капиллярный электрофорез (КЭ). Он позволяет анализировать ионные и нейтральные компоненты различной природы с высокой экспрессностью и уникальной эффективностью. В основе КЭ лежат электрокинетические явления - электромиграция ионови других заряженных частиц и электроосмос. Эти явления возникают в растворах при помещении их в электрическое поле высокого напряжения. Если раствор находится в тонком кварцевом капилляре, то электрическое поле, наложенное вдоль капилляра, вызывает в нем движение заряженных частиц и пассивный поток жидкости (электроосмотический поток, ЭОП), в результате чего проба разделяется на индивидуальные компоненты, так как параметры электромиграции специфичны для каждого вида заряженных частиц. В то же время, такие возмущающие факторы, как диффузионные, сорбционные, конвекционные, гравитационные и др., в капилляре заметно ослаблены, благодаря чему достигаются рекордные эффективности разделений.

Традиционно КЭ сравнивают с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ), поскольку в обоих методах разделение происходит в ограниченном пространстве (капилляре или колонке) с участием движущейся жидкой фазы (буферного раствора или подвижной фазы (элюента)) и для регистрации сигналов используют схожие принципы детектирования и программы обработки данных. Тем не менее, у методов есть отличия, относящиеся к достоинствам капиллярного электрофореза:

— высокая эффективность разделения (сотни тысяч теоретических тарелок), недоступная ВЭЖХ и связанная с плоским профилем ЭОП

— малый объем анализируемой пробы и буферов (не более 1–2 мл в день), при этом практически не требуется применение высокочистых, дорогостоящих органических растворителей

— отсутствие колонки, сорбента, проблем с его старением и, значит, заменой колонки

— простая и недорогая аппаратура

— экспрессность и низкая себестоимость единичного анализа.

Из ограничений КЭ следует отметить невысокую, по сравнению с ВЭЖХ, концентрационную чувствительность и требование к анализируемым соединениям растворяться в воде или водно-органических смесях. В то же время, недостаточную чувствительность определения при использовании УФ-детектирования (из-за малой длины оптического пути, равного внутреннему диаметру капилляра) может скомпенсировать использование таких видов детектирования, как лазерно-индуцированное флуориметрическое или масс-спектрометрическое в сочетании с различными приемами on-line концентрирования пробы (т. н. стэкинг и свиппинг).

Системы капиллярного электрофореза «Капель» предназначены для количественного и качественного определения состава проб веществ в водных и водно-органических растворах методом КЭ (табл. 3.1).

Таблица 3.1.

Технические характеристики приборов серии «Капель»

«Капель-103Р» - наиболее простая модель с ручным управлением и пошаговым принципом работы. В прибор устанавливается только одна пробирка с анализируемым раствором. На приборе любой модификации без ограничений могут быть реализованы методики, использующие основные варианты КЭ - капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) или мицеллярную электрокинетическую хроматографию (МЭКХ). Первый вариант предназначен для анализа только ионных компонентов проб, второй - для анализа ионных и молекулярных форм веществ.

В системах «Капель» можно задавать и изменять в ходе анализа: давление, напряжение, время анализа, температуру (для систем с жидкостным охлаждением капилляра), длину волны (модели 105/105М).

Принятые термины и сокращения

Время миграции (t_м)- время, необходимое компоненту для прохождения им эффективной длины капилляра (Lэфф) от зоны ввода пробы (начала капилляра) до зоны детектирования.

Электроосмотический поток (ЭОП)- течение жидкости в капилляре под действием приложенного электрического поля. Время, необходимое жидкости для преодоления эффективной длины капилляра вследствие возникающего ЭОП, называют временем ЭОП (t_эоп) и экспериментально определяют из электрофореграммы по времени миграции нейтрального компонента - маркера ЭОП.

Подвижность ЭОП (µ_эоп)- представляет собой отношение скорости ЭОП к напряженности электрического поля. Скорость ЭОП положительна при направлении движения жидкости от входного участка капилляра к детектору и отрицательна при обратном направлении. Скорость ЭОП вычисляют как: v_эоп = Lэфф / t_эоп. Напряженность электрического поля представляет собой отношение приложенной разности потенциалов (U) к общей длине капилляра (Lобщ). Таким образом, подвижность ЭОП вычисляют из экспериментальных данных: µ_эоп = Lобщ * Lэфф / t_эоп * U. Длину капилляра выражают в см.

Электрофоретическая подвижность частицы (µ_эф)- по аналогии с предыдущей величиной представляет собой отношение электрофоретической скорости частицы к напряженности электрического поля и может быть вычислена: µ_эф = Lобщ * Lэфф / t_м * U.

В отличие от µ_эоп электрофоретическую подвижность частицы нельзя определить непосредственно из электрофореграммы, поскольку время миграции частицы t_м в этом случае представляет собой сумму времен миграции собственно частицы и маркера ЭОП. Из эксперимента можно найти так называемую общую подвижность, которая выражается (при положительной скорости ЭОП): µ_общ = µ_эоп+µ_эф.

Зная из эксперимента µ_общ и µ_эоп можно легко рассчитать µ_эф.

Капиллярный электрофорез (КЭ)- метод разделения, реализуемый в капиллярах и основанный на различиях в электрофоретических подвижностях заряженных частиц как в водных, так и в неводных буферных электролитах. Буферные растворы (ведущие электролиты, рабочие буферы) могут содержать добавки (например, макроциклы, органические растворители, полимеры и др.), которые способны взаимодействовать с анализируемыми частицами и изменять их электрофоретическую подвижность. Этот метод известен также как капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ). Нейтральные компоненты не разделяются этим методом, все они мигрируют в зоне ЭОП.

Мицеллярная электрокинетическая капиллярная хроматография(МЭКХ) - метод разделения, основанный на комбинации электрофоретического и хроматографического принципов. В состав буферного раствора вводят поверхностно-активное вещество (ПАВ), которое формирует псевдостационарную мицеллярную фазу. Нейтральные компоненты пробы распределяются между этой фазой и буферным раствором согласно их гидрофобности.

Время миграции мицеллыэкспериментально определяют как время миграции компонента, полностью удерживаемого мицеллярной фазой. Маркером мицелл, например, является краситель судан 3.