Главная Случайная страница


Категории:

ДомЗдоровьеЗоологияИнформатикаИскусствоИскусствоКомпьютерыКулинарияМаркетингМатематикаМедицинаМенеджментОбразованиеПедагогикаПитомцыПрограммированиеПроизводствоПромышленностьПсихологияРазноеРелигияСоциологияСпортСтатистикаТранспортФизикаФилософияФинансыХимияХоббиЭкологияЭкономикаЭлектроника






Аппаратура и Общее устройство систем КЭ

Минимальный состав системы, реализующей метод капиллярного электрофореза, должен включать следующие узлы: кварцевый капилляр, источник высокого напряжения, устройство ввода пробы, детектор и систему сбора, обработки и вывода информации (рис. 2.5).

 

 

Рис. 3.5. Устройство системы капиллярного электрофореза.

Дополнительными устройствами в системах КЭ являются автосемплер и блок жидкостного охлаждения капилляра.

Капилляры

В системах КЭ используют капилляры из кварца, прозрачного в УФ-области спектра, с внешним полиимидным защитным покрытием. В случае детектирования внутри капилляра (on-line) полиимидное покрытие в зоне детектирования снимают, оставляя для прохождения света зону чистого кварца. Внутренний диаметр капилляров обычно составляет 50 или 75 мкм, внешний диаметр - 365 мкм, длина капилляров 20–100 см. Различают общую (Lобщ) и эффективную (Lэфф) длину капилляра: в первом случае речь идет о полной длине капилляра от входного до выходного конца, а во втором - об участке от входного конца до зоны детектирования (рис. 5).

Большинство разделений в КЭ ведут на непокрытых изнутри немодифицированных капиллярах. Их подготовка к анализу начинается с промывки раствором щелочи для обеспечения диссоциации силанольных групп кварца и возникновения ЭОП. Анализ соединений, способных адсорбироваться на стенках кварцевого капилляра (белки, красители), или необходимость обращения ЭОП требуют использования покрытых капилляров (ковалентные покрытия или динамические).

В зоне ввода пробы торцевой срез должен быть выполнен строго под углом 90° к боковым стенкам капилляра. В противном случае наблюдаются пики с «хвостами» или невоспроизводимый ввод пробы.

С точки зрения анализа кондиционное состояние капилляра следует понимать так, что выполняемые последовательно анализы должны быть воспроизводимы по временам миграции пиков и по площадям пиков. Общая скорость электромиграции иона складывается из скорости движения иона под действием электрического поля и скорости движения ЭОП. Первая зависит от природы иона, а вторая от свойств диффузной части двойного электрического слоя в капилляре, мерой которой является x-потенциал поверхности. Причиной нестабильности времен миграции может служить изменение диффузной части второй обкладки двойного электрического слоя. Различные примеси из ведущего электролита и растворов проб, сорбируясь на поверхности капилляра, уменьшают x-потенциал и, следовательно, увеличивают времена миграции компонентов. Сорбция может быть обратимой или практически необратимой в зависимости от химической природы примесей и состава электролита. Одновременно изменение времени миграции пика изменяет его ширину и площадь (площадь пика пропорциональна времени миграции: поздно мигрирующие компоненты перемещаются через зону детектирования медленнее).

При подготовке к работе капилляр обычно промывают раствором кислоты, водой и раствором щелочи. Цель первой операции заключается в удалении с поверхности примесей, в частности, многовалентных катионов, и первичном гидролизе силоксановых групп. Промывка водой способствует удалению кислоты и дальнейшему гидролизу поверхности. Наконец, щелочная промывка предназначена для удаления примесей, не реагирующих с кислотой, и максимальной диссоциации образовавшихся силанольных групп. Финишная промывка водой имеет целью удалить из капилляра щелочь. Для того чтобы теперь привести очищенную и подготовленную поверхность в равновесие с раствором ведущего электролита, капилляр промывают собственно раствором ведущего электролита. При правильно проведенном кондиционировании времена миграции контрольных или тестовых веществ остаются постоянными при последовательных вводах. Если времена миграции тестовых веществ уменьшаются, это свидетельствует о недостаточном времени кондиционирования.

При анализе на поверхности кварца могут сорбироваться различные примеси: многовалентные катионы, склонные к образованию гидроксокомплексов, катионные ПАВ, вещества белковой природы, обладающие свойствами амфолитов, нефтепродукты, некоторые полимеры и т. п. Все они нарушают структуру диффузного слоя и уменьшают x-потенциал, что приводит к уменьшению скорости ЭОП и к увеличению времени миграции анализируемых ионов.

Часть сорбированных примесей удаляется с поверхности при промывке раствором ведущего электролита (если сорбция обратимая), и, подбирая время промывки, удается при последовательных анализах сохранять постоянными времена миграции компонентов. Если же в пробах имеются примеси, сорбирующиеся практически необратимо, приходится периодически промывать капилляр растворами, которые способны удалить накопившиеся примеси, и далее снова кондиционировать капилляр относительно раствора ведущего электролита. Эффективным средством борьбы с такими примесями является их предварительное удаление на этапе подготовки пробы к анализу.

 

Источники высокого напряжения

Источники напряжения обеспечивают подачу постоянного напряжения в диапазоне от –25 до +25 кВ. Максимально допустимый ток в капилляре не должен превышать 200 мкА. В отношении величины тока в капилляре при анализе следует ориентироваться на следующие данные: <50 мкА - отлично; 50–75 мкА - хорошо; 75–100 мкА - нормально; 100–125 мкА - допустимо; >125 мкА - плохо.

Обычно переключение полярности происходит в ручном режиме со сменой высоковольтных блоков. Также существуют приборы с автоматическим переключением полярности, что в ряде анализов позволяет добиться эффекта концентрирования пробы на этапе ее ввода (внутри капилляра) - так называемое on-line концентрирование.

Безопасность работы достигается автоматическим отключением высокого напряжения при открывании крышки прибора или при достижении максимально допустимого тока нагрузки.

Запись кривых тока и напряжения и визуальный контроль их значений на мониторе компьютера могут указать на случайные нарушения во время анализа и полезны при поиске ошибки.

 

Ввод пробы

Типичный объем вводимой пробы в КЭ составляет 1–20 нл. Общепринято заполнять пробой не более 2 % объема капилляра, чтобы изначально не создавать широкую зону компонентов и обеспечить достаточное время нахождения зоны пробы в капилляре для установления значимых различий в электрофоретических подвижностях.

Непосредственно перед вводом пробы капилляр промывают рабочим буферным раствором, удаляя остатки пробы от предыдущего ввода.

Различают гидродинамический, электрокинетический и гидростатический способы ввода пробы. Первые два способа реализованы во всех системах капиллярного электрофореза; гидростатический способ не нашел широкого применения.

Ввод пробы давлением (гидродинамический, пневматический)обеспечивается созданием разницы давлений между сосудом для пробы и выходным концом капилляра, при этом давление обычно повышается в сосуде для пробы, в том числе в приборах «Капель». Объем вводимой пробы зависит только от разницы давлений и времени ввода пробы; при временах ввода порядка нескольких секунд разность давлений лежит в области нескольких миллибар (1000 мбар » 1 атм). При дозировании все системы КЭ оперируют величиной произведения давления на время ввода. Гидродинамический способ ввода не нарушает состав пробы и позволяет вводить ее из одной пробирки несколько раз.

Последовательность операций при гидродинамическом вводе:сначала на выходе погружают конец капилляра в рабочий буферный раствор, затем на входе - в пробу. Автоматически или в ручном режиме вводят пробу, после чего на входе заменяют пробу на рабочий буфер и переходят к анализу.

Электрокинетический ввод пробыосуществляется путем подачи высокого напряжения на электроды, когда на входе установлена пробирка с раствором пробы, а на выходе - с рабочим буфером. За счет возникающего ЭОП компоненты пробы перемещаются в капилляр. Количество введенной пробы при этом способе зависит от напряжения, времени, в течение которого приложено напряжение, и подвижности компонентов пробы. Особенностью этого ввода пробы является то, что компоненты с большей подвижностью концентрируются в капилляре по сравнению с малоподвижными ионами, которые в случае малого времени ввода, вообще могут не попасть в капилляр. По сравнению с гидродинамическим способом ввода наблюдается дифференциация состава пробы в капилляре и в исходном растворе. Электрокинетический способ ввода пробы подразумевает только однократный ввод образца из одной пробирки и наименее воспроизводим.

Гидростатический ввод пробыиспользует разницу в высоте между буферным сосудом и сосудом для проб. Гидростатическое давление создает поток жидкости в капилляре («сифонный» эффект) и вводит пробу в капилляр. Вводимое количество пробы зависит от разницы в высоте (обычно 5–10 см), времени (5–45 с), вязкости и плотности растворов электролита и пробы. Отметим, что гидростатическое давление служит причиной невоспроизводимости времен миграции, если во время анализа уровни буферного раствора во входной и выходной пробирках отличаются. Поэтому необходимо обращать внимание на правильное заполнение пробирок раствором ведущего электролита перед анализом (равными порциями, например по 500 мкл), своевременное их перезаполнение (через 5‑7 анализов), а также следует тщательно выверять установку прибора на горизонтальной плоскости.

 

Детекторы

Характеристики методов детектирования, используемых в КЭ, представлены в табл. 3.2. Указанные пределы детектирования позволяют оценить чувствительность того или иного детектора.

Детектирование в системах КЭ может осуществляться:

непосредственно у выходного конца капилляра в режиме реального времени. Этот способ характерен для большинства систем КЭ;

непосредственно на выходном конце капилляра;

вне системы КЭ, при этом, детектор представляет собой отдельный прибор (например, масс-спектрометр) и соединен с системой капиллярного электрофореза специальным интерфейсом.


Таблица 3.2.

Характеристики основных методов детектирования, применяемых в КЭ.

 

Детектирование Селек- тив ность Универ-саль-ность Качест-венная инфор-мация о веществе Детек-тирова-ние в капил-ляре Примерный предел детектирования, моль/л Частота исполь-зования, %
Прямое фотометрическое в УФ-области *(для диодной матрицы) + + * + 10-5-10-7
Косвенное фотометри-ческое в УФ-области + + 10-4-10-6
Флуориметрическое: прямое косвенное   + —   — +   — —   + +   10-7-10-9 10-6-10-8  
Индуцированное лазером флуориметрическое + + 10-13-10-16 5-7
Масс-спектрометрическое + + + 10-8-10-10
Амперометрическое: прямое косвенное   + —   — +   — —   — —   10-7-10-10 10-6-10-8   <1

 

В капиллярном электрофорезе используют те же принципы детектирования, что и в ВЭЖХ. Важным преимуществом КЭ перед ВЭЖХ, помимо плоского профиля ЭОП, является отсутствие соединительных гидравлических линий между узлами ввод пробы–капилляри капилляр–детектор, которые в случае ВЭЖХ могут приводить к уширению зоны вещества за счет внеколоночного размывания.

Основным вариантом детектирования является фотометрическое, основанное на поглощении веществом УФ или видимого света. Фотометрические детекторы в КЭ разделяются на несколько типов.

Детекторы с фиксированной длиной волны:источники света с линейчатым спектром - ртутная лампа (254 нм), кадмиевая лампа (229 нм) и цинковая лампа (214 нм). Это наиболее простые системы; в приборах «Капель-103, -104» фотометрический детектор работает при l = 254 нм, поэтому отклик детектора будет наблюдаться только тогда, когда определяемый компонент имеет заметное поглощение для указанной l. Этот случай называется прямым детектированием, электрофореграмма представляет собой набор положительных пиков, возвышающихся над базовой линией. Так определяются органические соединения с ароматической структурой или сопряженными двойными связями, некоторые неорганические соединения и др.

Детекторы с изменяемой длиной волны:источниками света служат дейтериевые (190–350 нм) и вольфрамовые (340–850 нм) лампы. Необходимая спектральная селекция достигается применением монохроматоров или узкополосных светофильтров.

В детекторах на диодной матрице (ДДМ) световой поток, прошедший через капилляр, разлагается в спектр с помощью высококачественного светосильного монохроматора, а матрица фотодиодов регистрирует сигналы в УФ и видимой частях спектра (УФ-В-детекторы), обеспечивая запись в режиме сканирования. Данные, полученные одновременно на 2-5 различных l, обрабатываются компьютером, выделяющим сигнал при оптимальной l и вычитающим фон. Применение ДДМ обеспечивает получение аналитических данных высокой достоверности. Например, при определении гомогенности (однородности) пика осуществляется спектральный контроль в максимуме и по обоим склонам пика. Если пик однороден, то все три спектра идентичны. Для индивидуального вещества отношение высот пиков на электрофореграммах, записанных при двух различных l, есть величина постоянная. Гомогенность пика проверяется также при сравнении параметров миграции соединения, полученных при двух разных l (для ДДМ обе электрофореграммы получаются в ходе одного анализа). Идентификацию пика проводят путем сравнения времен миграции и спектров стандарта и компонента пробы.

Для соединений, анализируемых с помощью КЭ и не поглощающих в УФ-диапазоне, возможна регистрация методом косвенного УФ-детектирования. В этом случае в состав ведущего электролита вводят хромофор - вещество, поглощающее на требуемой l. Так, в случае определения анионов используют поглощающий анион, например, CrO42- или фталат, а при определении катионов используют катионы ароматических аминов или гетероциклов, в частности, катион бензимидазолия. Так как ионная сила ведущего электролита в процессе разделения остается постоянной, в зоне, где находится непоглощающий ион, уменьшается концентрация поглощающего иона. Обмен происходит строго эквивалентно, на электрофореграмме наблюдаются обратные (отрицательные) пики, площади которых пропорциональны концентрациям ионов. Косвенное УФ-детектирование является универсальным и позволяет регистрировать все присутствующие в анализируемом растворе ионы.


Системы термостабилизации.

Сбор и обработка данных

Наиболее простым вариантом охлаждения капилляра является обдув воздухом. Также используют жидкостные системы термостатирования с диапазоном температур 4-70°С ± 0,1°С. Как правило, термостатируют только капилляры. Термостатирование автозагрузчика пробы ценно при анализе термолабильных образцов. После загрузки в автосемплеры проб, рабочих буферов и вспомогательных растворов измерения проводятся в автоматическом режиме по заданным параметрам.

Все приборы КЭ комплектуются программными продуктами, позволяющими записывать данные, проводить их качественную и количественную обработку, формировать отчеты. Некоторые программы способны также управлять системами капиллярного электрофореза.

 

Эффективность разделения

Метод КЭ характеризуется высокой эффективностью. Эффективность N, выраженная числом теоретических тарелок, может быть определена непосредственно из электрофореграммы по уравнению (3.1):

N = 5,55 * (tм / W1/2)2 (3.1)

где tм - время миграции аналита, W1/2 - ширина пика на ½ высоты.

Основными причинами, приводящими к снижению N, являются:

величина зоны вводимой пробы, определяемая длительностью ввода: в идеале она должна быть как можно меньше, однако достижение низких пределов обнаружения требует увеличения объема пробы или ее концентрирования;

температурный градиент: при анализе в капилляре протекает электрический ток, величина которого зависит от удельной проводимости буфера и диаметра капилляра (D). Отвод тепла происходит через стенки капилляра, что приводит к возникновению в буфере радиального температурного градиента. Разница в температуре между серединой и стенками капилляра возрастает пропорционально D2. Температура в центре капилляра может быть на 10°С выше, чем на внутренней стенке. Возникающий вследствие этого градиент вязкости приводит к тому, что вещество у стенки перемещается медленнее, чем в центре, что влечет за собой уширение полос и снижение эффективности;

адсорбция на стенках капилляра - взаимодействие веществ со стенками капилляра ведет к искажению формы пиков («хвосты»);


различия в электропроводностипробы и ведущего электролита: уширение пика, обусловленное электрофоретическими эффектами, пропорционально проводимости раствора образца относительно буфера. В случае высокой концентрации пробы градиент потенциала (и линейные скорости ионов) в зоне образца заметно ниже, чем в ведущем электролите. Благодаря этому происходит дестэкинг - уширение пиков. Обратная ситуация в соотношении проводимостей (стэкинг), наоборот, приводит к формированию узких пиков на электрофореграмме;

различия в уровне буферов во входном и выходном сосудах приводят к возникновению гидродинамического потока с параболическим профилем; чем больше диаметр капилляра, тем значительней это сказывается на эффективности разделения.

продольная диффузия в КЭ практически не дает уширения зоны вещества, что в основном обусловлено плоским профилем ЭОП.

 

Чувствительность метода

Основным способом детектирования в КЭ является фотометрический, чувствительность которого не всегда достаточна, поскольку детектирование происходит в слое малого внутреннего диаметра капилляра с низкой концентрацией пробы.

Подходы к увеличению чувствительности делятся на 3 категории: стратегия концентрирования образца; увеличение длины оптического пути; использование высокочувствительных селективных детекторов.

Стэкинг (stacking)- один из наиболее общих подходов к увеличению концентрационной чувствительности в КЭ. Стэкинг образца происходит, когда ионы аналитов пересекают границу, которая отделяет зону низкой проводимости раствора образца и высокой - ведущего электролита. В случае если матрица образца имеет значительно более низкую проводимость, чем ведущий электролит, в зоне образца возникает относительно высокое электрическое поле. Аналиты внутри зоны образца движутся с более высокой локальной скоростью, и, замедляясь на границе с зоной ведущего электролита, концентрируются. Стэкинг образца применителен только к заряженным аналитам.

Свипинг (sweeping)- техника концентрирования нейтральных частиц в МЭКХ, суть которой заключается в том, что аналиты концентрируются псевдостационарной фазой (мицеллой), которая проникает в зону образца, где мицеллы отсутствуют. При этом (в отличие от стэкинга) проводимость раствора образца близка проводимости ведущего электролита. В ряде случаев свипинг позволяет получать 100-кратные концентрирования (on-line).

Чувствительность метода КЭ с УФ-детектированием может быть повышена за счет увеличения длины оптического пути: зону детектирования выполняют в форме пузырька (увеличение сигнала в 3–5 раз), используют капилляры Z-формы (увеличение сигнала в 20–40 раз).

Чувствительности определения способствует снижение уровня шума детектора за счет стабилизации светового потока ламп и учета флуктуаций интенсивности потоков в каналах фотометра.

 

Последнее изменение этой страницы: 2016-07-23

lectmania.ru. Все права принадлежат авторам данных материалов. В случае нарушения авторского права напишите нам сюда...