Загальна характеристика транскрипції

На відміну від реплікації ДНК, тісно пов'язаної з клітинним поділом, транскрипція ДНК відбувається практично в усіх еукаріотичних клітинах - як тих, що діляться, так і тих, що не діляться.

Причому в клітинах, що діляться, вона здійснюється в будь-який момент мітотичного циклу, окрім періоду реплікації (у еукаріот) і власне поділу. У прокаріот, мабуть, немає і цього обмеження: клітинний цикл буває таким коротким (20-40 хв), що реплікація і транскрипція відбуваються одночасно, тільки на різних ділянках молекули ДНК (яка у бактерій є кільцевою).

Більше того, транскрипція якої-небудь ділянки ДНК може здійснюватися не лише майже у будь-який момент циклу, але і багаторазово. З іншого боку, набір ділянок, що транскрибуються в клітині, під дією тих або інших чинників нерідко змінюється.

Ферментативне забезпечення процесу здійснюється РНК-полімеразою. У еукаріот - три види цього ферменту :

· РНК-полімераза I - для синтезу про-рРНК,

· РНК-полімераза II - для синтезу про-мРНК

· РНК-полімераза III - для синтезу про-тРНК.

Фермент повзе уздовж ДНК і каталізує почергове включення в зростаючий ланцюг рибонуклеотидів, комплементарних нуклеотидам матричного ланцюга ДНК.

Субстратами синтезу РНК є рибонуклеозидтрифосфати (рНТФ); як і при синтезі ДНК, в ході включення в ланцюг, що будується, вони втрачають пірофосфатні залишки:

вільні залишки рНМФ →залишки рНТФ в ланцюзі, що будує ланцюги РНК + пірофосфат

Це забезпечує процес енергією, так що додаткових її джерел не вимагається.

Ще одна схожість з синтезом ДНК полягає у напрямі зростання ланцюга, що будується, - 5´→3'. Це означає, що у цього ланцюга нуклеотиди приєднуються до 3´-кінця.

Як при усіх матричних синтезах, ланцюг, що будується, антипараллельний матричному ланцюгу ДНК. Отже, остання транскрибується ферментом у напрямі 3'→5'.

Але є і принципові відмінності від синтезу ДНК.

а) Асиметричність процесу : в якості матриці, як ми знаємо, використовується лише один ланцюг ДНК. Не зовсім ясно, як ферментна система здійснює правильний вибір потрібного ланцюга. Мабуть, ключову роль тут відіграють певні послідовності нуклеотидів на одному з ланцюгів, впізнанні системою.

б) Консервативність процесу : молекула ДНК по закінченню синтезу РНК повертається в початковий стан. При синтезі ж ДНК молекули наполовину оновлюються, що робить репликацию напівконсервативною.

в) Нарешті, синтез РНК не вимагає для свого початку ниякої приманки, тоді як при реплікації ДНК потрібна РНК-приманка.

Механізм транскрипції

Ініціація транскрипції

Перший і, мабуть, найважливіший етап транскрипції - це її ініціація: зв'язування РНК полімерази з промотором і утворення першого міжнуклеотидного зв'язку.

Про зв'язування РНК-полімерази ми говорили вже не раз, тому зараз лише нагадаємо основні моменти (з додаванням деяких відомостей).

У бактерій РНК-полімераза безпосередньо впізнає певну послідовність нуклеотидних пар в складі промотора - наприклад, бокс Прибнова. У цьому впізнаванні бере участь спеціальний білок - т. з. δ-фактор. Потім до нього приєднується РНК-полімераза, яка складається з тетрамер з субодиниць трьох видів : α, β і β' (див.мал.).

У деяких оперонах, наприклад в лактозному, потрібна ще попередня взаємодія з промотором додаткового білку (САР).

У еукаріот завжди вимагається попереднє зв'язування з промотором цілої сукупності білків - загальних чинників транскрипції, з утворенням комплексу ТFIID). Крім того, ініціація транскрипції гена залежить від інших чинників транскрипцій, що взаємодіють з енхансерами цього гена.

Зв'язавшись з промотором, РНК полімераза викликає локальну денатурацію ДНК, тобто розподіл ланцюгів ДНК на протязі приблизно 1,5 витка ДНК (15 нуклеотидных пар). Як то кажуть, утворюється транскрипція "вічко" . Завдяки цьому нуклеотиди матричного ланцюга ДНК в області "вічка" стають доступними для спаровування з рНТФ.

Першим в ланцюг РНК, що будується, завжди включається пуриновий нуклеотид - АТФ або ГТФ, причому усі три його фосфатні залишки зберігаються.

Потім утворюється перший 5´, 3 '- фосфатний зв'язок з другим нуклеотидом.

Після цього у бактерій δ-фактор втрачає зв'язок з ферментом, і субодиниці (що утворюють т. з. кор-фермент), що залишилися, починають переміщатися по ДНК.

У еукаріот, мабуть, теж РНК-полімераза після іниціації транскрипції втрачає зв'язок з факторами транскрипцій і переміщається по ДНК самостійно.

Елонгація транскрипції

Етап, що йде за ініціацією, - елонгація: поступове подовження зростаючого ланцюга про-РНК до остаточного розміру.

Це відбувається у міру просування РНК-полімерази по ДНК. Відповідно, переміщається і "вічко" транскрипції, тобто ділянка локального розплітання ДНК. На транскрибованій же частині ДНК дволанцюжкова спіральна структура відновлюється відразу після відходу РНК-полімерази.

Зразкова швидкість руху ферменту і синтезу РНК - 30 нуклеотидів в секунду.

Транскрипція може супроводжуватися помилками спаровування, в результаті яких в РНК, що синтезується, включаються "неправильні" нуклеотиди. В середньому одна така помилка доводиться на 2 х 10⁴ включених нуклеотидів. Це істотно частіше, ніж поява нерепарованих помилок реплікації (одна помилка приблизно на 10¹⁰ нуклеотидних пар).

Очевидно, менша точність транскрипції пов'язана з тим, що помилки тут мають не такі серйозні наслідки. Вони легко компенсуються завдяки утворенню на одному гені безлічі копій про-РНК.

Крім того, внаслідок виродженості генетичного коду, не кожна заміна нуклеотиду змінює зміст кодона мРНК. Можна знайти, що в 67 % помилок, що стосуються третіх положень кодонів, зміст останніх залишається тим самим.

Термінация транскрипції

Останній етап термінація, або закінчення транскрипції.

Сигналом для цього служать спеціальні ГЦ-збагачені ділянки у кінці генів. Оскільки сила взаємодії пар ГЦ досить велика, локальна денатурація таких ділянок в ДНК відбувається важче. Це уповільнює просування РНК полімерази і може служити для неї сигналом для зупинки транскрипції.

Але ще до закінчення процесу у кінці новосинтезированої РНК теж встигає з'явитися ГЦ-збагачена ділянка. Завдяки взаємодії між своїми нуклеотидами, вона утворює "шпильку". Тобто взаємодії з нуклеотидами матричного ланцюга ДНК замінюються на "внутрішньошпилькові" взаємодії. Це полегшує від'єднання РНК від ДНК.

У бактерій цьому часто сприяє і спеціальний білок - Rho-фактор. Він рухається по ДНК услід за РНК-полімеразою, наздоганяє її на ГЦ-ділянці гена і, володіючи активністю, полегшує розбіжність ланцюгів РНК і ДНК.

Конвеєрний характер процесу

Досі ми мали на увазі одну молекулу РНК-полімерази і утворення одного ланцюга про-РНК.

Але насправді через якийсь час після того, як попередня молекула РНК-полімерази, покидає промотор, просунеться по ДНК на деяку відстань, з промотором зв'язується наступна молекула ферменту і теж починає транскрипцію.

Тому на кожному гені, що транскрибується, зазвичай працюють, рухаючись один за одним, відразу декілька молекул РНК-полімерази (див.мал.).

Середня відстань між ними залежить від "сили" промотора (багато в чому обумовленою транскрипційними чинниками) і концентрації РНК-полімерази. Середній порядок цієї відстані - 300-500 н. п.

Відповідно, з одним геном одночасно пов'язано декілька зростаючих ланцюгів про-РНК.

Таким чином, транскрипція гена відбувається конвейєрним способом.

Інгібітори транскрипції

Є немало речовин, що специфічно інгібують транскрипцію. Найбільш відомі з них α-аманітин і актиноміцин D.

α-Аманітин - це один з токсинів отруйних грибів (зокрема, блідої поганки). Він є цикличним пептидом, що включає ряд незвичайних амінокислот.

Цей пептид дуже міцно зв'язує РНК-полімеразу II (у еукаріот) і блокує тим самим синтез попередників матричних РНК (на стадії елонгації).

Актиноміцин D - антибіотик; точніше, це похідний природного антибіотика з Streptomytes. Він містить два ідентичних циклічних пентапептиди, сполучених з гетероциклічною системою.

Актиноміцин міцно зв'язується з ГЦ-збагаченими ділянкими ДНК. Це блокує просування РНК-полімерази - через неможливість локального розплітання ланцюгів.

Особливо чутливий до цього інгібітору синтез попередників рибосомальних РНК, оскільки їх гени дуже збагачені ГЦ-парами.

Продукти транскрипції

Як ми вже не раз підкреслювали, в результаті транскрипції у еукаріот (на відміну від прокаріот) утворюються лише попередники тих або інших РНК - мРНК, рРНК і тРНК.

Знаючи структуру зрілих ланцюгів РНК кожного виду, порівняємо з нею будову відповідних про-РНК.

а) Про-мРНК (див.мал.). Ці ланцюги зазвичай в кілька разів довші, ніж зрілі мРНК.

Дійсно, вони, по-перше, включають транскрипти спенсерів (що є регуляторними ділянками, відділи із структурною функцією і т. д.).

По-друге, кодуюча частину про-мРНК, як і в початковому гені, перериваєте інтронами. При цьому інтронні послідовності нерідко утворюють "шпильки".

Довжина про-мРНК не лише більша, ніж у мРНК, але і значно сильніше варіює у ріхних молекул - від 2 тис. до 20 тис. нуклеотидів. Тому даний вид РНК часто називають гетерогенною ядерною РНК (гяРНК).

Інша особливість про-мРНК - відсутність на 5'- кінці "ковпачка" (кепа), а на 3'-кінці - пів(А) -фрагмента.

В більшості випадків про-мРНК еукаріот несуть інформацію про синтез лише одного пептидного ланцюга, тобто дають при дозріванні тільки одну молекулу мРНК.

Серед виключень з цього правила - гістонова про-мРНК. Як вказувалося кластер гистонових генів транскрибується як єдине ціле, а при дозріванні про-мРНК з останньої "нарізається" 5 різних гистонових мРНК.

Наявність подібних виключень - ще одна відмінність про-мРНК від мРНК: усі зрілі мРНК еукаріот, без будь-яких виключень, є моноцистронними.

б) Про-рРНК (див мал. Вище Б). Кластер трьох генів рРНК теж транскрибується як єдине ціле. Про-рРНК, що утворюється, або 45S - PHK, містить послідовності відразу трьох зрілих рРНК - 18S-, 5,8S- і 28S - pPHK.

Ці послідовності розділені спейсерами, але не містять інтронів. Крім того, в них немає модифікованих нуклеотидів, що містяться в зрілих рРНК.

в) Про-тРНК (див.мал. нижче В). На відміну від про-рРНК, усі про-тРНК (за одиничним виключенням у бактерій) містять послідовності лише одної тРНК.

При цьому вже на рівні про-тРНК утворюється типова структура "листка конюшини". Проте остання ще відрізняється від остаточної: в ній

- є ряд додаткових послідовностей (з обох кінців і в середині молекули);

- відсутні мінорні нуклеотиди;

- не сформована типова послідовність акцепторної петлі (ЦЦА);

- антикодон не займає свого "правильного" положення.

З усього вищесказаного ясно, що безпосередні продукты транскрипції дійсно піддаватися певним (і істотним) змінам для того, щоб перетворитися на функціонально активні ланцюги РНК.

ДОЗРІВАННЯ (ПРОЦЕСИНГ) РНК

Практично усі процеси дозрівання РНК можуть бути поділені на три типи:

- видалення одних

- приєднання інших

- модифікація тих же або третіх нуклеотидів.

Видалення "зайвих" послідовностей

Загальний опис

Видалення "зайвих" нуклеотидів здійснюється спеціальними нуклеазами. Екзонуклеази послідовно відщеплюють з певного кінця ланцюга (3' або 5') по одному нуклеотиду. А ендонуклеази розрізають ланцюг десь в середніх ділянках, призводячи до її фрагментації.

Перерахуємо процеси дозрівання, що йдуть за участю нуклеаз.

а) В першу чергу, це відщеплення окремих "зайвих" нуклеотидів з кінців ланцюга. Так, в про-РНК з 5 '- кінця завжди зходиться АТФ або ГТФ, а з 3´-кінця нерідко - ГЦ-ділянки. Вони відіграють важливу роль в самому процесі транскрипції, але не потрібні і навіть заважали б при функціонуванні зрілого ланцюга, і тому видаляються.

б) Крім того, з кінців ланцюгів відщепляються спейсерні послідовності нуклеотидів (якщо такі є). Мабуть, зазвичай для цього використовуються ендонуклеази.

в) Такі про-РНК, як 45S-пре-рРНК і гістонова про-мРНК, розрізаються ендонуклеазами на індивідуальні ланцюги РНК.

г) Нарешті, з середніх ділянок про-тРНК і практично усіх (окрім гістонових) про-мРНК вирізуються інтронні послідовності. При цьому екзонні послідовності зшиваються один з одним в безперервний ланцюг. Цей процес (вирізування інтронів і зшивання екзонів) позначається як сплайсинг.

Очевидно, для його здійснення вимагаються не лише ендонуклеази, але і лігази (що каталізують з'єднання екзонів).

Правда, у деяких простих (Tetrahymena) видалення інтрону з однієї про-РНК відбувається без участі яких-небудь білків-ферментів, тобто каталізується самою про-РНК. Це дуже цікаво в еволюційному плані, але все-таки далеко від зазвичай використовуваного у еукаріот механізму.

Механізм сплайсингу

Один з ключових моментів даного механізму (див.мал.) - забезпечення точності розрізання ланцюга про-РНК: помилка навіть на один нуклеотид призведе до "зрушення рамки", що змінить вміст усіх кодонів мРНК або антикодону тРНК.

Точність досягається завдяки двом обставинам. По-перше, на початку і у кінці кожного інтрону є певні послідовності нуклеотидів: так, інтрони завжди починаються з Г-У, а кінчаються дуплетом А-Г. По-друге, для впізнавання цих послідовностей використовуються спеціальні РНК - т. з. малі ядерні РНК (мяРНК). Останні пов'язані з ферментами, що каталізують сплайсинг. Такі рибонуклеопротеїдні комплекси називаються сплайосомами.

Сплайсинг починається з взаємодії двох мяРНК з початком і кінцем інтрону. Це дає "орієнтацію" для ендонуклеази: остання діє на межі двох- і одноланцюгових ділянок.

Перший розрив про- РНК відбувається в області 5' кінця інтрону - на мал. це місце знаходження лівого краю лівої мяРНК. При цьому 5' кінець інтрону зв'язується з одним з нуклеотидів в середній частині того ж інтрону, що призводить до утворення кільцевої (чи, точніше, ласоподобной) структури.

Тому перша (на малюнку - ліва) мяРНК, мабуть, дисоціює, а ферментний комплекс переміщується до іншої (на малюнку - правої) мяРНК, що маркує 3 '- кінець інтрону. Тут відбувається другий розрив про-РНК - по місцю знаходження "правого" кінця "правої" мяРНК. Точніше, зв'язок екзона 2 з інтроном замінюється на зв'язок з екзоном 1.

Отже, обидва розриви здійснюються одним і тим же способом - шляхом заміщення одного межнуклеотидного зв'язку на інший такий же зв'язок.

З порушенням механізму сплайсингу пов'язаний один з видів β-талассемії - генетичного захворювання, при якому порушене утворення β-ланцюгів гемоглобіну. У хворих з т. з. β-талассемією в гені β-глобина заміщена всього одна нуклеотидная пара, причому навіть не в кодуючій частині, а в інтроні. Але в результаті в інтроні β-глобинової про- мРНК з 5 '- кінця виявляється не Г, а А. Тому не відбувається впізнавання цього кінця з боку мяРНК, інтрон не вирізується і зріла мРНК не утворюється.