ИСКУССТВЕННЫЕ И СИНТЕТИЧЕСКИЕ ЖИРЫ

Очень давно человек обнаружил, что растительные и животные жиры обладают ценными свойствами и могут быть использованы не только как продукты питания.

Химики нашли вещества, которые оказались по своему строению очень похожими на жирные кислоты, выделяемые из природных жиров. Обнаружены они были среди продуктов, получаемых из нефти. Имеются в виду высокомолекулярные парафиновые углеводороды — вещества, входящие в состав известного всем парафина. Так, очень незначительно, например, отличие в строении пальмитиновой кислоты и парафинового углеводорода – гексадекана:

пальмитиновая кислота

гексадекан

Сравнение этих веществ показало, что для получения искусственных жирных кислот нужно к парафиновым углеводородам «прибавить» кислород, то есть окислить их. На этом и основано производство заменителей пищевых жиров. Жирные кислоты получаются из недефицитных продуктов переработки нефти.

Но если принцип синтеза жирных кислот очень прост, то сам процесс их получения достаточно сложен. Промышленный синтез жирных кислот представляет собою крупное современное производство. Оно состоит из трех этапов: окисления парафина и получения так называемой смеси сырых кислот, их «облагораживания» (очищения от примесей) и, наконец, разделения «облагороженной» смеси на отдельные фракции жирных кислот.

Окисление парафина производится в больших аппаратах — колоннах, заполненных расплавленным парафином, в массе которого находится катализатор. Снизу с помощью распыляющего устройства подают сильную струю воздуха, который проходит сквозь толщу парафина. В результате кислород соединяется с парафиновыми углеводородами и превращает их в жирные кислоты.

В составе парафина находится много различных углеводородов с числом атомов углерода от 18 до 36. Они вступают во взаимодействие с кислородом с разной скоростью; кроме того, при этом наблюдается множество побочных реакций. В результате наряду с жирными кислотами выделяется ряд менее ценных веществ. Поэтому после реакции окисления производят очистку жирных кислот от примесей. Окисленный парафин откачивают и промывают; при этом теплая вода уносит из него отработанный катализатор и некоторые ненужные вещества. Чтобы отделить жирные кислоты от основной массы всех остальных веществ, не вступивших в реакцию, парафин подается в смеситель, где обрабатывается раствором соды. При этом жирные кислоты превращаются в мыльный раствор. Затем на втором этапе производства эту смесь подвергают тепловой обработке: она нагревается в печи под высоким давлением до 320 ⁰С и подается в испаритель. Здесь вода и еще оставшиеся в составе кислот вредные примеси испаряются, уносятся вверх и попадают в холодильник, а «облагороженный» раствор стекает вниз. Он направляется в мешалку, где обрабатывается серной кислотой в присутствии сульфата натрия. Серная кислота, разрушая мыло, выделяет жирные кислоты в свободном состоянии, так сказать, возвращает им нормальный вид. Далее жирные кислоты промываются и сушатся. И, наконец, наступает третий, последний этап производства. Смесь жирных кислот проходит через вакуум-аппараты, при этом из нее выделяются отдельные, необходимые промышленности фракции жирных кислот. Процесс этот совершается многократно. Подобным способом вырабатывается большое количество жирных кислот — до 920 килограммов из одной тонны парафина. Так в общих чертах осуществляется синтез жирных кислот.

Отходы, получаемые при «облагораживании» жирных кислот, не выбрасываются. В составе этих веществ находятся углерод, водород и кислород — те элементы, из которых «строятся» жирные кислоты. В дальнейшем они используются поэтому как сырье: смешиваются с новой порцией парафина и вместе с ним снова подвергаются окислению. Синтетические жирные кислоты почти лишены цвета, запаха и посторонних примесей. Они мало отличаются от кислот, выделенных из растительных и животных жиров.

В наши дни искусственные жирные кислоты все более заменяют природные жиры в разных отраслях промышленности. Они используются в производстве мыла вместо дефицитного кокосового масла, с помощью которого раньше изготовлялись высокосортные туалетные сорта, а также вместо хлопкового масла и саломаса (гидрированный растительный жир), использовавшегося для производства бытового хозяйственного мыла.

Из синтетических жирных кислот приготовляются теперь различные смазочные материалы, которые вырабатывались прежде из растительных жиров. Синтетические кислоты успешно конкурируют с природными при изготовлении высококачественных олиф. Искусственные жиры — ценнейший материал в производстве резины: они заменяют необходимую для этого стеариновую кислоту, которую выделяют из дорогостоящего стеарина.

5.4 БИОХИМИЯ ИММОБИЛИЗОВАННЫХ ФЕРМЕНТОВ

Одним из перспективных направлений, стоящих на стыке биохимии и современной биотехнологии является технология создания иммобилизованных ферментов. Ферменты, а даже целые ферментные системы, широко используются в различных отраслях промышленности, медицине, сельском хозяйстве и т.д.

Ферменты как вещества белковой природы весь восприимчвы к действиям окружающей среды (температура, свет и т.п.), именно по этой причине они весьма неустойчивы при хранении. Кроме того, ферменты не могут быть использованы многократно из-за трудностей в отделении их от субстратов и продуктов реакций. Выход из данной ситуации был предложен в начале ХХ века когда Дж. Нельсон и Е. Гриффин адсорбировали на угле инвертазу и показали, что она сохраняет в таком виде свою каталитическую активность. Принцип создания иммобилизованных ферментов заключается в прикрепление их в активной форме к нерастворимой основе или заключение в полупроницаемую мембранную систему.

Прикрепление (иммобилизация) ферментов к носителю осуществляется адсорбционно, химической связью или путем механического включения фермента в органический или неорганический гель (в капсулу и т. п.). При этом прикрепление молекулы фермента ведется за счет функциональных групп, не входящих в активный центр фермента и не участвующих в образовании фермент-субстратного комплекса.

В качестве носителя иммобилизованного фермента могут выступать вещества органической и неорганической природы; зернистой или волокнистой структуры; пластинчатой, трубчатой, шарообразной (капсулярной) формы и т.д.

Необходимо отметить, что органические носители (низко- и высокомолекулярные) могут быть как синтетического, так и природного происхождения. Синтетические полимерные носители подразделяют на группы в связи с химическим строением основной цепи макромолекул: полиметиленовые, полиамидные, полиэфирные. Природные полимерные органические носители, получившие наибольшее распространение, делят в соответствии с их биохимической классификацией на 3 группы: полисахаридные, белковые и липидные.

Наиболее часто для иммобилизации используются такие полисахариды, как целлюлоза, декстран, агароза и их производные. Целлюлоза гидрофильна, имеет много гидроксильных групп, что позволяет модифицировать её, замещая эти группы (см. п. 5.3). Для увеличения механической прочности целлюлозу гранулируют путем частичного гидролиза, в результате которого разрушаются аморфные участки. На их место для сохранения пористости между кристаллическими участками вводят химические сшивки. Гранулированную целлюлозу легко превратить в различные ионообменные производные, такие как ДЭАЭ-целлюлоза, КМЦ и др.

Широкое распространение получили природные носители на основе декстрана, имеющие общее «сефадексы». При высушивании они легко сжимаются, в водных же растворах способны к сильному набуханию. Пористость образуемых сефадексами гелей может регулироваться степенью полимеризации углевода, а также характером и числом сшивок (чаще всего «сшивка» осуществляется формальдегидом). Подобные водорастворимые препараты часто используются как носители лекарственных средств в медицине и фармакологии.

Белки в качестве носителей обладают рядом достоинств: вместительны, способны к биодеградации, могут применяться в качестве тонкой (толщиной 80 мкм) мембраны. Иммобилизацию ферментов на белковых носителях проводят как в отсутствии, так и в присутствии сшивающих агентов. Белки используются и в фундаментальных биологических исследованиях, и в медицине. К недостаткам белков в качестве носителей относят их высокую иммуногенность (за исключением коллагена и фибрина). Наиболее для иммобилизации используются структурные (кератин, фибрин, коллаген), двигательные (миозин) и транспортные (альбумин) белки.

Синтетические полимерные носители применяются для ковалентной и сорбционной иммобилизации ферментов, для получения гелей, микрокапсул. Они могут иметь макропористую, изопористую структуру, а также гетеропористую структуру. Для получения полимерных гидрофильных носителей широко используется акриламид - производное акриловой кислоты.

Преимущества иммобилизованных ферментов перед нативными предшественниками:

- иммобилизованный фермент может быть легко отделим от реакционной среды, что позволяет приостановить реакцию в любой момент, использовать фермент повторно, или получать чистый от фермента продукт;

- реакцию можно проводить непрерывно, регулируя ее скорость, а также выход продукта;

- возможно изменение ряда свойств иммобилизованного фермента (специфичность, зависимость активности фермента от значений рН среды, ионного состава, деуствия денатурирующих агентов);

- возможна регуляция активности иммобилизованных ферментов путем изменения свойств самого носителя.

Методы иммобилизации ферментов

Существует два основных метода иммобилизации ферментов: физический и химический.

Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации фермент не связан с носителем ковалентными связями. Существует четыре типа связывания ферментов:

- адсорбция на нерастворимых носителях;

- включение в поры геля;

- пространственное отделение фермента от остального объема реакционной системы с помощью полупроницаемой перегородки (мембраны);

- включение в двухфазную среду, где фермент растворим и может находиться только в одной из фаз.

Адсорбционная иммобилизация является наиболее старым из существующих способов иммобилизации ферментов. Этот способ достаточно прост и достигается при контакте водного раствора фермента с носителем. После отмывки неадсорбировавшегося белка иммобилизованный фермент готов к использованию. Удерживание адсорбированной молекулы фермента на поверхности носителя может обеспечиваться за счет неспецифических ван-дер-ваальсовых взаимодействий, водородных связей, электростатических и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными группами белка. Вклад каждого из типов связывания зависит от химической природы носителя и функциональных групп на поверхности молекулы фермента

Преимуществами метода адсорбционной иммобилизации является его простота, доступность и дешевизна сорбентов, выступающих в качестве носителей. Им также можно придать любую конфигурацию и обеспечить требуемую пористость. При адсорбционном связывании можно решить и проблему очистки фермента, так как связывание белка с носителем во многих случаях достаточно специфическое. К недостаткам адсорбционной иммобилизации следует отнести низкую прочность связывания фермента с носителем, отсутствие общих рекомендаций, позволяющих сделать правильный выбор носителя и оптимальных условий иммобилизации конкретного фермента.

Некоторых из перечисленных затруднений можно избежать при иммобилизации ферментов путем включения в гели. Суть этого метода иммобилизации состоит в том, что молекулы фермента включаются в трехмерную сетку из тесно переплетенных полимерных цепей, образующих гель. Среднее расстояние между соседними цепями в геле меньше размера молекулы включенного фермента, поэтому он не может покинуть полимерную матрицу и выйти в окружающий раствор, т.е. находится в иммобилизованном состоянии. Дополнительный вклад в удерживание фермента в сетке геля могут вносить также ионные и водородные связи между молекулой фермента и окружающими ее полимерными цепями. Пространство между полимерными цепями в геле заполнено водой, на долю которой обычно приходится значительная часть всего объема геля. Например, широко применяемые гели полимеров акриловой кислоты в зависимости от концентрации полимера и его природы содержат от 50 до 90% воды.

Для иммобилизации ферментов в геле существует два основных способа. При одном из них фермент помещают в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате чего образуется полимерный гель с включенными в него молекулами фермента. В реакционную смесь часто добавляют также бифункциональные (содержащие в молекуле две двойные связи) сшивающие агенты, которые придают образующемуся полимеру структуру трехмерной сетки. В другом случае фермент вносят в раствор готового полимера, который затем каким-либо образом переводят в гелеобразное состояние. Способ иммобилизации ферментов путем включения в полимерный гель позволяет создавать препараты любой геометрической конфигурации, обеспечивая при этом равномерное распределение биокатализатора в объеме носителя. Метод универсален, применим для иммобилизации практически любых ферментов, полиферментных систем, клеточных фрагментов и клеток. Фермент, включенный в гель, стабилен, надежно защищен от инактивации вследствие бактериального заражения, так как крупные клетки бактерий не могут проникнуть в мелкопористую полимерную матрицу. В то же время, эта матрица может создавать значительные препятствия для диффузии субстрата к ферменту, снижая каталитическую эффективность иммобилизованного препарата, поэтому для высокомолекулярных субстратов данный метод иммобилизации не применим вообще.

Общий принцип иммобилизации ферментов с использованием мембран заключается в том, что водный раствор фермента отделяется от водного раствора субстрата полупроницаемой перегородкой. Полупроницаемая мембрана легко пропускает небольшие молекулы субстрата, но непреодолима для крупных молекул фермента. Существующие модификации этого метода различаются лишь способами получения полупроницаемой мембраны и ее природой. Водный раствор фермента можно включать внутрь микрокапсул, представляющих собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой полимерной стенкой (микрокапсулирование). При двойном эмульгировании получается водная эмульсия из капель органического раствора полимера, содержащих, в свою очередь, еще более мелкие капли водного раствора фермента. Через некоторое время растворитель затвердевает, образуя сферические полимерные частицы с иммобилизованным в них ферментом. Если вместо водонерастворимого отвердевающего полимера используются жидкие углеводороды с высокой молекулярной массой, метод называется иммобилизацией путем включения в жидкие мембраны. К модификациям метода иммобилизации ферментов с использованием полупроницаемых оболочек относятся также включение в волокна (при этом вместо капель, содержащих ферменты, получаются нити) и включение в липосомы. Применение систем мембранного типа позволяет получать иммобилизованные препараты с высоким содержанием фермента. Метод, как и предыдущий, достаточно универсален, т.е. применим как ферментам, так и к клеткам, а также их фрагментам. Благодаря высокому отношению поверхности к объему и малой толщине мембраны удается избежать значительных диффузионных ограничений скорости ферментативных реакций. Основной недостаток мембранных систем - невозможность ферментативного превращения высокомолекулярных субстратов.

При иммобилизации ферментов с использование систем двухфазного типа ограничение свободы перемещения фермента в объеме системы достигается благодаря его способности растворяться только в одной из фаз. Субстрат и продукт ферментативного превращения распределяются между обеими фазами в соответствии с их растворимостями в этих фазах. Природа фаз подбирается таким образом, что продукт накапливается в той из них, где фермент отсутствует. После завершения реакции эту фазу отделяют и извлекают из нее продукт, а фазу, содержащую фермент, вновь используют для проведения очередного процесса. Одним из важнейших преимуществ систем двухфазного типа является то, что они позволяют осуществлять ферментативные превращения макромолекулярных субстратов, которые невозможны при применении жестких носителей с ограниченным размером пор.

Главным отличительным признаком химических методов иммобилизации является то, что путем химического взаимодействия на структуру фермента в его молекуле создаются новые ковалентные связи, в частности между белком и носителем. Препараты иммобилизованных ферментов, полученные с применением химических методов, обладают по крайней мере двумя важными достоинствами. Во-первых, ковалентная связь фермента с носителем обеспечивает высокую прочность образующегося конъюгата. При широком варьировании таких условий, как рН и температура, фермент не десорбируется с носителя и не загрязняет целевых продуктов катализируемой им реакции. Это особенно важно при реализации процессов медицинского и пищевого назначения, а также для обеспечения устойчивых, воспроизводимых результатов в аналитических системах. Во-вторых, химическая модификация ферментов способна приводить к существенным изменениям их свойств, таких как субстратная специфичность, каталитическая активность и стабильность. Химическая иммобилизация ферментов является искусством, уровень которого определяется, в первую очередь, умением экспериментатора. Основная задача экспериментатора заключается в формировании новых ковалентных связей в молекуле фермента при использовании его функциональных групп, несущественных для проявления его каталитической активности. При химической модификации фермента его активный центр желательно защищать. При сопоставлении различных приемов иммобилизации химические методы для крупномасштабных биотехнологических процессов кажутся малопривлекательными из-за сложности и дороговизны. В промышленных процессах обычно используются те или иные методы физической иммобилизации.