Значение анализирующего скрещивания.

Гаметы с хромосомами, претерпевшими кроссннговер, называют кроссоверными (а организмы - кроссоверамиили рекомбинантами), а с непретерпевшими–некроссоверными.

Разная частота появления особей в анализирующем скрещивании позволяет:
1 - утверждать о том, что гены сцеплены;

2 - установить силу сцепления (частоту кроссинговера) между этими генами;

3 - установить частоту образования кроссоверных гамет и гамет родительского типа (100% - G К, где G К - частота кроссоверных гамет);

4 - определить генотип гетерозиготного родителя (по классам особей родительского типа, т.е. особей, возникающих с большей частотой).

Следует помнить, что генотип кроссоверных гамет и, как следствие, кроссоверных особей, зависит от исходного положения доминантных аллелей в гомологичных хромосомах дигетерозиготной особи (цис- и транс- положения).

Значение тетрадного анализа.

Тетрадный анализ – комплекс методов, направленных на определение генотипа особи по генотипу микроспор тетрады или четырех гамет, образованных в результате гаметического расщепления в процессе мейоза. Тетрадный анализ используется при изучении организмов, образующих стабильные, но в последствие распадающиеся тетрады (водоросли, грибы).

(На примере сумчатого гриба) Каждая из аскоспор содержит 4 гаплоидные споры с удвоенным количеством ДНК(n2c). Следовательно, расщепление в аскоспорах соответствует гаметическому расщеплению (после I деления мейоза, когда и происходит рекомбинация, предшественники половых клеток имеют генетическую формулу n2c, которая при последующем митотическом делении становится nc, так как каждая клетка отдаёт по одному комплекту ДНК дочерним клеткам).

По этой причине расщепление в тетрадах моногетерозиготы A/a соответствует 2A : 2а, а у дигетерозиготы AB/ab наблюдается 3 вышеописанных типа тетрад: родительский дитип 2АВ : 2ав, неродительский дитип 2Ав : 2аВ и тетратип 1АВ : 1Ав : 1аВ : 1ав. Частота появления каждого из этих типов тетрад даёт право делать выводы о сцеплении генов и центромер (сцеплённые участки рекомбинируют вместе). Кроме того, на основании того, что частота кроссинговера зависит от расстояния между генами, можно судить и о расстоянии между генами или генами и центромерами.

Тетрадный анализ помог установить, что кроссинговер происходит на стадии четырёх, а не двух хроматид. Если бы кроссинговер происходил на стадии двух хроматид, то при скрещивании АB :ab наблюдалось бы единственное линейное расположение Ab-Ab-Ab-aB-aB-aB. В действительности же обычно наблюдаются куда более сложные варианты расположений, например, AB-AB-Ab-Ab-aB-aB-ab-ab и Ab-Ab-AB-AB-aB-aB-ab-ab. Это связано с тем, какие именно хроматиды из четырёх вступили в рекомбинацию.

Цитологические доказательства кроссинговера.

После того как генетическими методами удалось установить явление кроссинговера, необходимо было получить прямое доказательство обмена участками гомологичных хромосом, сопровождающегося рекомбинацией генов. Наблюдаемые в профазе мейоза картины хиазм могут служить лишь косвенным доказательством этого явления, констатация происшедшего обмена прямым наблюдением невозможна, так как обменивающиеся участками гомологичные хромосомы обычно абсолютно одинаковы по величине и форме.

Г. Крейтон и Б. МакКлинток удалось получить у кукурузы форму, у которой гомологичные хромосомы различались морфологически – одна была нормальной, а другая несла утолщение на конце одного плеча, второе ее плечо было удлинено. Эти особенности в строении пары хромосом легко обнаруживались при цитологических исследованиях.

В опыте нормальная хромосома несла рецессивный ген с (colorless – неокрашенный эндо-сперм) и доминантный ген wx+ (крахмалистый эндосперм), измененная хромосома – доминантный ген с+ (окрашенный эндосперм) и рецессивный ген wx (waxy – восковидный эндосперм). Дигетерозиготу с+ сwx+ wx скрещивали с линией, имеющей морфологически нормальные хромосомы, меченные рецессивными генами с и wx. В потомстве получили как некроссоверные, так и кроссоверные зерна. При цитологическом изучении их было обнаружено, что кроссоверные зерна неизменно содержали хромосомы с обменявшимися участками: нормальной длины, но с утолщением или удлиненную без утолщения.

К. Штерн исследовал расщепление в потомстве от скрещивания самок дрозофил, дигетерозиготных по генам Х-хромосомы: cr (carnation) глаза цвета гвоздики, рецессив; cr+ - нормальная темно-красная окраска глаз, доминант; B (Bar) – полосковидные глаза, доминант: B+ - круглые глаза, рецессив.

Эти же самки несли гетероморфные Х-хромосомы: одну сильно укороченную вследствие транслокации ее бесцентромерного участка на четвертую – микрохромосому, другую – Г-образную – вследствие транслокации на нее фрагмента Y-хромосомы. Таких самок скрещивали с самцами, несущими рецессивные аллели исследуемых генов (cr, B+) в Х-хромосоме обычной формы и имевшими обычную Y-хромосому. Результат кроссинговера у самок в таком скрещивании – рекомбинантные классы – изучали цитологически.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 14

1. Половые хромосомы, гомо- и гетерогаметный пол; типы хромосомного определения пола. Наследование признаков, сцепленных с полом. Значение реципрокных скрещиваний для изучения сцепленных с полом признаков. Наследование при нерасхождении половых хромосом. Балансовая теория определения пола. Гинандроморфизм.

Половые хромосомы, или гоносомы, — хромосомы, набор которых отличает мужские и женские особи у животных и растений с хромосомным определением пола.

Дрозофилы: ♀ и ♂ имеют 4 пары хромосом, три из которых одинаковы у тех, и у других, а одна пара у ♀ представлена двумя одинаковыми Х-хромосомами. А у ♂ - одной Х и одной Y-хромосомой. Y от Х отличается по форме и она почти целиком состоит из гетерохроматина. При скрещивании ♀ образую только один тип гамет (гомогаметный пол), а ♂ - два типа гамет (гетерогаметный пол). Случайное сочетание этих гамет ♀ и ♂ обеспечивает статистически равное число самцов и самок в каждом поколении. Y-хромосома не определяет пола, но в ней находятся гены фертильности самцов. (Х0-самцы стерильны).

Хромосомный механизм определения пола широко распространён в природе. Различают несколько типов хромосомного определения пола в зависимости от того, какой пол гетеро- и гомогаметный.

У растений хромосомный механизм подразделяется на 2 типа: 1) активную роль в определении пола играет Y-хромосома (муж.пол) 2) пол определяется балансом аутосом и Х-хромосом, Y-хромосома инертна.
Т.о. гетерогаметен ♂ пол (ХY), ♀, как правило гомогаметен (ХХ), за исключением некоторых видов.

У части животных (пчелы, муравьи, осы) существует гапло-диплоидный тип определения пола. У них нет половых хромосом. ♀ развиваются из оплодотворённых яиц и они диплоидны, а ♂ - из неоплодотворённых, и они гаплоидны.

Сцепление с полом: крисс-кросс - в результате признаки отцов проявляются у дочерей, а признаки матерей — у сыновей. Название такому типу наследования дал один из авторов хромосомной теории наследования Томас Хант Морган. Он впервые описал такой тип наследования для признака цвета глаз у дрозофилы в 1911 году. Крисс-кросс наследование наблюдается тогда, когда мать является гомозиготой по рецессивному признаку, локализованному в Х-хромосоме, а у отца в единственной Х-хромосоме имеется доминантный аллель этого гена.

Реципрокные скрещивания — два эксперимента по скрещиванию, характеризующиеся прямо противоположным сочетанием пола и исследуемого признака. В одном эксперименте самца, имеющего определенный доминантный признак, скрещивают с самкой, имеющей рецессивный признак. Во втором, соответственно, скрещивают самку с доминантным признаком и самца с рецессивным признаком. Используется для определения роли пола в наследовании признака, а также позволяет определить, от какого из родителей передаются потомству цитоплазматические наследственные факторы. Для проведения реципрокного скрещивания родительские формы должны быть чистыми линиями.

Как показал Морган, при скрещивании белоглазых самок дрозофилы с красноглазыми самцами дочери оказываются красноглазыми, а сыновья - белоглазыми. Однако из правила бывают исключения. Примерно у одной из двух тысяч мух в F₁ от такого скрещивания цвет глаз оказывается противоположным: белым у самок и красным у самцов. Бриджес предположил, что появление редких мух возможно при нерасхождении Х-хромосом - когда Х-хромосомы не расходятся в мейозе к разным полюсам, а направляются вместе к одному из полюсов, в результате чего образуются яйцеклетки с двумя Х-хромосомами и яйцеклетки без Х-хромосом. Если у белоглазой мухи образуется яйцеклетка с двумя Х-хромосомами и эта яйцеклетка оплодотворяется спермием, содержащим Y-xpoмосому, то образовавшаяся зигота имеет две Х-хромосомы и одну Υ-хромосому, причем обе Х-хромосомы содержат ген белых глаз. Бриджес предположил, что белоглазые самки в потомстве от скрещивания между красноглазыми самцами и белоглазыми самками развиваются именно из таких зигот. Когда же яйцеклетка, не содержащая ни одной Х-хромосомы, оплодотворяется спермием красноглазого самца, несущим Х-хромосому, то в зиготе оказывается одна Х-хромосома, несущая ген красных глаз, а Y-хромосомы нет вовсе. Бриджес предположил, что из таких зигот развиваются красноглазые самцы. Другими словами, гипотеза Бриджеса состояла в том, что появляющиеся с частотой 1 :2000 белоглазые самки получают по две Х-хромосомы от матери (и Y-хромосому от отца), а такие же редкие красноглазые самцы получают лишь одну отцовскую Х-хромосому (и, следовательно, вовсе лишены Y-хромосомы). Самцы дрозофилы, лишенные Y-хромосомы, внешне нормальны, но стерильны. Самки с двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой нормальны и плодовиты. Бриджес скрещивал таких самок (ΧΧΥ) с нормальными красноглазыми самцами (ΧΥ). Он обнаружил, что около 4% самок в потомстве от таких скрещиваний имеют белые глаза, а около 4% самцов - красные глаза; остальные 96% потомства составляли красноглазые самки и белоглазые самцы. Бриджес предположил, что эти 4% составляют самки и самцы, возникающие снова в результате нерасхождения Х-хромосом в мейозе у самок. Он назвал такое нерасхождение вторичным, поскольку оно происходит в потомстве самок, появившихся в результате первичного нерасхождения Х-хромосом (и потому обладающих двумя Х-хромосомами и одной Y-хромосомой). Вторичное нерасхождение происходит с частотой около 1 :25, т. е. примерно в 100 раз чаще, чем первичное нерасхождение (1 :2000).

Распределение хромосом может нарушаться не только в мейозе, но и в митозе. Изредка получались мухи, у которых один глаз белый, а другой – красный. И оказывается, что у таких мух одна половина тела женская, а другая – мужская. Такие мухи называются гинандоморфами. Белый глаз принадлежит мужской половине. Такие особи возникают в результате потери одной Х-хромосомы при первом делении ядра зиготы, которая должна дать начало самке.

Балансовая теория Бриджеса. Пол у дрозофил определяется соотношением числа аутосом (А) и половых хромосом (Х).

3Х:3А – триплоидные самки

2Х:2А – самки

1Х:2А – самцы

2Х:3А – интерсексы

3Х:2А – суперсамки

1Х:3А – суперсамцы

Принципы регуляции действия генов у эукариот. Транскрипционно активный хроматин. Регуляторная роль гистонов, негистоновых белков, гормонов. Особенности организации промоторной области у эукариот. Посттранскрипционный уровень регуляции синтеза белков. Роль мигрирующих генетических элементов в регуляции генного действия.

Все клетки любого организма имеют полный набор свойственных данному организму генов. У любого организма клетки разных тканей и органов отличаются по набору имеющихся в них белков. Даже в одной клетке на разных стадиях ее развития синтезируются и функционируют разные белки. Следовательно, располагая полной генетической информацией, каждая клетка на определенном этапе развития использует лишь ту ее часть, которая необходима в настоящий момент, транскрибируются только те гены, продукты которых нужны клетке в данный момент для отправления ее функций. Следовательно, клетка должна располагать механизмами, определяющими, какие гены и в какой последовательности должны транскрибироваться. По принципам регуляции гены эукариотов можно условно разделить на три группы: 1) функционирующие во всех клетках организма; 2) функционирующие только в тканях одного типа; 3) обеспечивающие выполнение специализированными клетками конкретных функций. Для эукариотической клетки характерно:

1. Наличие интронов и экзонов в молекуле ДНК.

2. Созревание и-РНК - вырезание интронов и сшивка экзонов.

3. Наличие регуляторных элементов, регулирующих транскрипцию, таких как: а) промоторы - 3 вида, на каждый из которых садится специфическая полимераза. РНК-полимераза I реплицирует рибосомные гены, РНК-полимераза II - структурные гены белков, РНК-полимераза III - гены, кодирующие небольшие РНК. Промоторы РНК-полимеразы I и РНК-полимеразы II находятся перед участком инициации транскрипции, промотор РНК-полимеразы III - в рамках структурного гена; б) модуляторы - последовательности ДНК, усиливающие уровень транскрипции; в) (энхансеры) усилители - последовательности, усиливающие уровень транскрипции и действующие независимо от своего положения относительно кодирующей части гена и состояния начальной точки синтеза РНК; г) терминаторы - специфические последовательности, прекращающие и трансляцию, и транскрипцию.

Несмотря на индивидуальность набора регуляторных элементов у структурных генов эукариот, каждый из них имеет промоторный участок (ТАТА-бокс, или бокс Хогнесса) из восьми нуклеотидов, включающий последовательность TATA; последовательность ССААТ (САТ-бокс); участок из повторяющихся динуклеотидов GC (GC-бокс). Эти элементы находятся на расстоянии 25, 75 и 90 п.н. от сайта инициации соответственно. Транскрипция структурного гена эукариот начинается со связывания с ТАТА-боксом фактора транскрипции, который представляет собой комплекс по крайней мере из 14 белков. Затем с ним и участками ДНК, примыкающими к ТАТА-боксу, связываются другие факторы транскрипции, и, наконец, со всем этим транскрипционным комплексом связывается РНК-полимераза II. Затем при участии дополнительных факторов происходит инициация транскрипции.

В ядрах дифференцированных клеток хроматин имеет такую укладку, что только небольшое число генов (часто менее 1%) доступно для транскрипции. Различают участки гетерохроматина, в которых ДНК упакована очень компактно и недоступна для транскрипции, и участки эухроматина, имеющие более рыхлую укладку и способные связывать РНК-полимеразу. В разных типах клеток в область эухроматина попадают разные гены, а это означает, что в разных тканях транскрибируются разные участки хроматина.

Стойкая репрессия генов гетерохроматинаобеспечивается:

· пространственной укладкой ДНК, при которой гетерохроматин находится в высококонденсированном состоянии;

· метилированием дезоксицитидина ДНК-ме-тилазами в 5'-CG-3' последовательностях ДНК. Эта модификация сильно меняет кон-формацию хроматина и препятствует активной транскрипции;

· связыванием с гистонами и образованием нуклеосом, которые также снижают транскрипционную активность ДНК.

Области эухроматина,в которых расположены активно транскрибируемые гены, обладают некоторыми структурными особенностями:

· они более чувствительны к действию ДНК-аз, чем остальные участки ДНК;

· молекулы гистонов, связанные с ДНК в этих участках, модифицированы. Результат этой серии ковалентных модификаций - снижение суммарного, положительного заряда гистонов и ослабление сродства нуклеосом к ДНК.

· к областям "активного" хроматина присоединяется группа негистоновых HMG-бел-ков, или белков с высокой подвижностью при гель-электрофорезе. Эти белки содержат много положительно заряженных аминокислотных остатков, связывание с которыми ослабляет взаимодействие ДНК и гистонов и вызывает дополнительное повышение транскрипционной активности генов.

С помощью методов молекулярной биологии было исследовано регуляторное действие гистонов и негистоновых хромосомных белков. Как выяснилось, гистоны, особенно гистон H1, оказывают тормозящее действие на ДНК-зависимый синтез РНК. Негистоновым хромосомным белкам тоже приписывают специфические регуляторные функции. Эти белки снимают блокирующее действие гистонов. На их важную роль указывают, помимо прочего, их большое многообразие, неодинаковое содержание их в хроматине различных тканей и на различных стадиях развития, а также результаты экспериментов по реконструкции хроматина.

ЭКЗАМЕНАЦИОННЫЙ БИЛЕТ № 15

Закономерности наследования при моногибридном скрещивании, открытые Г. Менделем: единообразие гибридов первого поколения, расщепление во втором поколении. Представление Г. Менделя о дискретной наследственности.

При моногибридном скрещивании гомозиготных особей, имеющих разные значения альтернативных признаков, гибриды являются единообразными по генотипу и фенотипу.