На показатель преломления и процент белка по Рейссу

Определение чистоты гамма-глобулиновой фракции. Проводят электрофоретически. Для этой цели применяют боратный буфер (на 5 л буфера берут: борной кислоты – 43,414 г; NаОН – 14,0 г; концентрированную НСl –12,7 мл) и краситель, содержащий в 1 л 5 % уксусной кислоты, 2 г хлористого аммония, 10 г каломеля и 1 г бромфенол синего. Смесь оставляют на ночь при помешивании и фильтруют. Режим разгонки - 16-18 часов при силе тока 0,5 ма на 1см ширины бумажной ленты.

Определение стерильности препарата. Проводят путём высевов гамма-глобулина на питательные среды МПБ и МПА. Посевы выдерживают при 37⁰ С в течение 8 суток.

Определение безвредности препарата. Контроль на безвредность проводится с использованием лабораторных животных - морских свинок и белых мышей.

Морским свинкам весом 250-350 г вводят подкожно 3 мл, а белым мышам весом 15-20 г - 0,5 мл гамма-глобулина. За животными наблюдают 5-7 дней. За это время у морских свинок не должно быть воспалительных реакций на месте введения препарата, мыши должны оставаться здоровыми.

Контроль на специфичность. Проводят в случаях получения специфического иммунного гамма-глобулина. Проводится так же, как и контроль соответствующей иммунной сыворотки. Дозы гамма-глобулина берут в 5-10 раз меньше доз исходной сыворотки.

Для определения специфичности гамма-глобулина проводят реакцию агглютинации на стекле, используя в качестве антигена микроорганизм, антитела против которого должны находиться в препарате. При положительной реакции образуются хлопья, следовательно гамма-глобулин обладает специфичностью.

Также вводят белым мышам подкожно 0,01 мл гамма-глобулина и 500 млн микробных клеток возбудителя. Если изменений в общем состоянии животных не наблюдается, препарат является специфичным.

Хранение гамма-глобулина и срок годности.

Гамма-глобулин должен храниться при температуре 4⁰-10⁰ С. Срок годности гамма-глобулина - 1,5-2 года с момента изготовления препарата.

Получение гамма-глобулина на биопредприятиях

Как упоминалось выше, иммуноглобулины выделяют из гипериммунных сывороток.

Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринированием плазмы. Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путём удаления форменных элементов и фибрина, называются нативными в отличие от сывороток, подвергнутых дополнительной очистки и концентрации специальными методами.

Но прежде чем приготовить сывороточные и глобулиновые препараты, необходимы ещё два этапа - отбор животных-продуцентов и гипериммунизация животных.

Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных белковых фракций, преимущественно гамма-глобулинов, и удалении балластных фракций, не являющихся носителями антител.

Выделенные фракции растворяют в меньшем объёме растворителя, по сравнению с исходным объёмом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить животному в меньших дозах.

В производственных условиях очистку и концентрацию сывороток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим следующие стадии:

- ферментативный гидролиз;

- прогрев ферментативных сывороток в кислой среде;

- солевое фракционирование;

- дополнительная очистка от неактивных белков;

- использование органических растворителей, сорбентов;

- дополнительное выдерживание сывороток при пониженных температурах.

При такой обработке удаляется до 80-85 % балластных белков сыворотки (Тутов И. К. 1997 г).

Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. Производственные опыты по ультрафильтрации сывороток дали возможность сконцентрировать их в три раза и практически без потерь иммуноглобулинового компонента.

Получение гамма-глобулина риваноловым методом

В условиях хозяйства

В условиях хозяйства можно легко и просто получить гамма-глобулин риваноловым методом и использовать его для профилактики болезней молодняка и лечения больных животных.

Например. Берут кровь от клинически здоровых коров хорошей упитанности (вакцинированных против различных инфекционных болезней; животных-реконвалесцентов, не являющихся микробоносителями; за 2 месяца до отела или через 2 недели после отела).

От одной коровы можно брать до 3 литров крови из яремной вены.

Кровь отстаивают при комнатной температуре до полного свертывания и отделяют сыворотку. К 100 мл сыворотки крови добавляют 30 мл 3 %-ного раствора риванола (этакридин лактат). Сыворотка мутнеет, в результате выпадения в осадок альбуминов, альфа- и бета-глобулинов, которые связываются с риванолом. Смесь сыворотки и риванола отстаивают в течение 30 минут в условиях холодильника (4° С). Затем в полученный раствор добавляют поваренную соль (NaCl) из расчета 0,5-0,8 % к объему раствора (0,65-1,04 г на 130 мл объема сыворотки с риванолом) для дополнительного осаждения балластных белков и уплотнения осадка. Смесь сыворотки, риванола и соли отстаивают в течение 1 часа при комнатной температуре и фильтруют через бумажные обеззоленные фильтры. На фильтре остаются альбумины, альфа- и бета-глобулины, а также риванол, в фильтрате - гамма-глобулин.

Раствор гамма-глобулина должен быть прозрачным, желтоватого или розоватого цвета. Препарат фасуют в стерильные стеклянные флаконы и закрывают резиновыми пробками. Флаконы и пробки стерилизуют кипячением в течение 1 часа.

Затем проводят контроль качества готового препарата.

В условиях хозяйства можно провести контроль на стерильность и безвредность полученного гамма-глобулина.

Для определения стерильности укупоренный флакон гамма-глобулина помещают в теплое место (возле батареи или калорифера) на 3 суток. Стерильный раствор гамма-глобулина через 3 суток останется прозрачным. Если раствор помутнел, значит в нем размножаются микроорганизмы. Всю полученную партию гамма-глобулина бракуют.

Для определения безвредности полученного гамма-глобулина, его вводят здоровому теленку в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы подкожно или внутримышечно. Если препарат безвреден, то изменений в общем состоянии животного не наблюдается.

Полученный гамма-глобулин применяют подкожно, для профилактики желудочно-кишечных и респираторных болезней молодняка животных в дозе 0,5 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 2 дня подряд, с терапевтической целью – в дозе 1,0 мл на 1 кг живой массы 1 раз в день 3 дня подряд. Первую инъекцию гамма-глобулина животному вводят дробно: вначале 1:10 дозы, через 15 минут (если не отмечаются отклонения в общем состоянии животного) вводят оставшееся количество препарата. Гамма-глобулин, полученный риваноловым методом, можно также давать животным внутрь.

Гамма-глобулин должен храниться при t = 4⁰ С, в темном месте. Срок годности 0,5-1,0 год с момента изготовления препарата.