КЛАССИФИКАЦИЯ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ БИОСУБСТРАТОВ

Все лабораторные методы изучения биосубстра­тов могут быть разделены на два класса:

— препаративные методы, связанные с получением из исходной биопробы некоторого (или нескольких) ее компонента;

— аналитические методы, позволяющие не только обнаружить, но и количественно оценить параметры обнаруженного компонента.

Препаративные методы применяются для разделения биосуб­страта на составляющие его компоненты для последующего исследования. В дальней­шем продукт, полученный препаративным методом, может быть изу­чен с помощью того или иного аналитического метода, например для оценки его качества.

Отличием любого аналитического метода является то обстоятель­ство, что внешнее энергетическое воздействие всегда используется для получения измерительного эффекта, в то время как в препаративных методах внешние энергетические воздействия применяются только лишь для разделения вещества на составляющие его компоненты.

Изучаемые свой­ства биопробы являются определяющими при выборе типа измерительных пре­образователей, они задают алгоритмы обработки сигналов и способы представления результатов.

Другие критерии классификации:

1.Вид анализа: качественный, количественный, структурный.

При качественном анализе (идентификации) определяется состав исследуемого материала, при этом выясняют, из каких атомов, молекул, ионов и радикалов состоит вещество пробы.

Для количественного анализа характерно определение количественных соотношений между компонентами пробы либо концентрации конкретного компонента.

Структурный анализ позволяет выявить взаимное расположение атомов (молекул) вещества в пространстве.

2. Степень избирательности (специфичности или селективности) метода. Высокоизбирательными являются методы, с помощью которых можно определить наличие конкретного вещества в средах сложного состава с близкими характеристиками различных компонентов (например, полярография, атомно-абсорбционная спектроскопия и др.).

3. Количество вещества, необходимого для анализа. По объему био­пробы различают: макропробы — 0,5–100 г, полумикропробы — 0,01–0,5 г, микропробы — 0,001–0,01 г, ультрамикропробы — менее 0,001 г. Необходимо учитывать, что выбор метода часто определяется тем количеством биосубстрата, которое имеется в распоряжении ис­следователя.

4. Наличие математической или иным способом установленной зави­симости между интенсивностью сигнала на выходе анализатора и концентрацией исследуемого компонента. Различают абсолютные и относительные методы исследования.

Абсолютными называются такие методы, для которых известна точная математическая зависимость между значением измеряемого физического параметра и исследуемым свойством пробы.

Вот несколько примеров таких измерений. Для метода гравимет­рии известно, что масса вещества строго зависит от концентрации. В методах титрования объем добавленного титранта определяет количе­ство исходного компонента, вступившего в реакцию. В кулонометрии используется закон Фарадея, связывающий массу вещества на электро­де с количеством электричества, затраченного на восстановление. Оп­тическая плотность раствора в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бэра пропорциональна концентрации молекул поглотителя лучистого потока.

Большинство современных аналитических методов являются отно­сительными: исследователь сам в фиксированных условиях конкрет­ного эксперимента устанавливает соотношение между интенсивностью аналитического сигнала и концентрацией исследуемого вещест­ва. Такая процедура называется градуировкой (калибровкой) сигнала (метод калибровочного графика). При этом требуется использование некоторого объекта, который принимается за эталон, причем важно, чтобы его свойства были стабильными, неизменными во времени.

5. Основной критерий - Характерное свойство анализируемого компонента, которое проявляется и фиксируется в процессе анализа. Три класса аналитиче­ских методов: химические, биологические и физико-химические.

В основе группы химических методов лежит использование хими­ческих реакций (химического взаимодействия молекул), при которых легко фиксируется параметр реакции, однозначно связанный с изу­чаемым свойством, например, с концентрацией компонента в исходной биопробе. Как правило, это реакции типа:

,

где — исследуемый компонент; — реагент; — продукт реак­ции.

В основе биологических методов — методов биотестирования — лежит свойство живых организмов давать характерный отклик на воз­действие окружающей среды измененного химического состава. В роли организмов-биоиндикаторов могут выступать живые клетки организмов, микроорганизмы, плесневые грибы, насекомые, рыбы и другие представители биологического мира.

Известно, что любые организмы для своей жизнедеятельности тре­буют среды строго определенного химического состава. Если его из­менить, исключив из питательной среды некоторый компонент или введя его дополнительно, то организмы через определенное время обя­зательно подадут соответствующий отклик — тоже своеобразный ана­литический сигнал, на основе которого можно построить техническое средство для изучения реакций популяции. Такой сигнал может быть выражен изменением характера поведения, интенсивностью рос­та и размножения (для микроорганизмов, животных клеток), измене­ниями физиологических функций кровообращения, пищеварения, ды­хания (для сложных организмов) и т. д.

Чаще всего методы этой группы используются в целях биотестиро­вания объектов ОС для группового обнаружения некоторых вредных компонентов в очень малых концентрациях — ионов тяжелых метал­лов, пестицидов, биологически активных веществ (БАВ) и др.

Фи­зико-химические методы. С помощью этих методов удается непо­средственно оценить тип, концентрацию и свойства путем измерения значений физических параметров исследуемой биопробы. Эти методы также можно разбить на несколько подгрупп:

— механические методы, основанные на измерении пара-метров механических свойств вещества (объем, плотность, вязкость, прони­цаемость и т. п.);

— электрохимические методы, основанные на измерении пара­метров электрических свойств вещества (сопротивление или прово­димость, импеданс, потенциал, количества электричества и т. п.);

— миграционные методы, в которых до начала измерения пара­метров отдельных компонентов присутствует обязательный этап предварительного разделения биопробы на компоненты. При этом су­ществуют два варианта разделения — за счет взаимодействия каждой компоненты с другими, специально введенными веществами или при воздействии биопробы с внешним полем, при котором скорости пере­мещения отдельных компонентов различаются. (Используются при пробоподготовке) Делятся на:

-электрофоретические методы, в которых используются про­цессы электрофореза — миграции (перемещения) заряженных частиц в жидкой среде во внешних электрических полях;

- хроматографические методы, в основе которых лежат процес­сы хроматографии — неравномерного распределения (разделения) ком­понентов смеси между веществами неподвижной (стационарной) и подвижной фаз, обусловленные различным сродством компонентов биопробы к этим фазам.

— методы с излучениями, основанные на взаимодействии веще­ства пробы с различными (внешними или собственными) излучениями; можно выделить две подгруппы — оптические методы и методы, основанные на эффектах ядерной физики.

Оптические методы измерения основаны на использовании раз­личных физико-химических явлений, возникающих при взаимодействии излучения оптического диапазона с веществом пробы: изменении ин­тенсивности, фазы, пространственной ориентации, спектрального со­става излучений и т. п. Нашли применение все три оптических диапа­зона электромагнитного излучения — ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный.

Оптические методы широко используются в аналитических лабо­раториях.

Большую подгруппу оптических методов составляют также мето­ды спектрального анализа, в которых для изучения состава биопро­бы и определения концентраций компонентов исследуются оптические спектры излучения и поглощения вещества. В спектральном анализе можно выделить как методически, так и по области применения: атомно-эмиссионный, в том числе и метод пламенной фотометрии; атомно-абсорбционный и атомно-флуоресцентный анализ. Данные методы отличаются необходимостью предварительного перевода ис­следуемой пробы в атомарное состояние.

Методы лабораторного анализа, основанные на эффектах ядер­ных взаимодействий, включают ряд методов (масс-спектрометрия, гамма-спектрометрия, рентгеноструктурные методы, электронная микроскопия и др.), позволяющих изучать тонкую структуру мно­гокомпонентных биопроб. Они основаны на взаимодействиях веще­ства с различного рода проникающими (волновыми и корпускуляр­ными) излучениями, эффекты которых проявляются на молекуляр­ном и атомарном уровнях.

— многофакторные методы, основанные на формировании из­мерительного сигнала при одновременном воздействии нескольких внешних факторов, например, двух физических полей разного типа или разных параметров. Такие методы в основном используются при научных исследованиях и редко применяются в клинических лабора­ториях.

Приведем краткую характеристику первых четырех групп.

Группа 1. В практике лабораторного анализа наибольшее распро­странение получили методы измерения объемов, удельного веса, вяз­кости и сил поверхностного натяжения, размеров и массы дисперсных фаз, параметров движения частиц, взвешенных в жидкой среде под действием гравитационных полей. Разрабатываются также методы, ос­нованные на измерении параметров распространения звуковых и ульт­развуковых волн в веществе пробы. Это простые и доступные в мето­дическом отношении методы, не требующие для выполнения исследо­ваний сложной измерительной техники. Аналитические возможности методов из этой группы ограничены, но они нашли применение в ка­честве препаративных при подготовке биопробы к последующему ана­лизу.

Группа 2. Методы данной группы, как правило, базируются на взаимодействии молекул биопробы с электронами на поверхности электродов с последующим образованием ионов (реакции окисления и восстановления) или на регистрации ее электрических характеристик (электрического импеданса, проводимости, диэлектрической проницае­мости и др.). Эти методы позволяют кодировать информацию о свой­ствах вещества непосредственно в форме электрического сигнала, наиболее удобной для дальнейшего преобразования. А общая черта, объе­диняющая электрохимические методы в одну подгруппу, заключена в учете комплексного характера взаимодействия объекта исследования (биопробы), электродной системы и электрического поля. В подгруппе представлен широкий диапазон методов, с помощью которых удается определять различные неорганические и органические соединения, ферментативную и иммунную активность, оценивать белковый состав, проводить дисперсионный анализ суспензий и т. п.

Любой из электрохимических методов может быть использован как для прямых измерений, основанных на получении зависимости аналитического сигнала от состава вещества или выраженности свой­ства биопробы, так и для косвенных методов (например, при индика­ции конечной точки титрования). Эта группа методов нашла примене­ние и при решении препаративных задач.

Группа 3. Эта группа включает две основные подгруппы:

— электрофоретические методы, в которых используются про­цессы электрофореза — миграции (перемещения) заряженных частиц в жидкой среде во внешних электрических полях;

— хроматографические методы, в основе которых лежат процес­сы хроматографии — неравномерного распределения (разделения) ком­понентов смеси между веществами неподвижной (стационарной) и подвижной фаз, обусловленные различным сродством компонентов биопробы к этим фазам.

Электромиграционные методы позволяют проводить идентифика­цию и определение концентрации различных макромолекул, микрочас­тиц, клеток по их подвижности в направлении силовых линий электри­ческого поля. Они играют важную роль в исследованиях белков и их компонентов, нуклеиновых кислот, пептидов, аминокислот и т. п., по­скольку, используя незначительные количества исследуемого вещест­ва, дают возможность проводить очень тонкое фракционирование. Ме­тоды позволяют быстро решить вопрос о качественном и количествен­ном составе исследуемой биопробы, а также проверить чистоту белко­вых препаратов, полученных любыми способами.

Известны и другие методы, использующие миграционные эффекты под действием внешнего поля, например, такие, как магнитомиграционные методы (магнитофорез), основанные на эффекте перемещения компонент биопробы с разной скоростью при воздействии магнитны­ми полями. Но они пока не нашли широкого применения в практике изучения биологических материалов.

Следует обратить внимание на то, что многие методы разделения и концентрирования, отнесенные к первой группе, такие, как отгонка, седиментация, диализ, мембранные методы, экстракция, фильтрование, ионный обмен и т. п., как раз относятся к классу препаративных и в первую очередь используются для выделения конкретных веществ либо для проведения пробоподготовки. Это связано с тем, что одна из основных задач пробоподготовки состоит в выделе­нии (концентрировании) из исследуемого вещества пробы отдельных фракций и компонентов, необходимых для дальнейшего анализа. Как правило, в этом случае используется один из нескольких приемов, осу­ществляемых посредством специального оборудования:

— физико-механический принцип разделения, например центрифу­гирование;

— электрофоретическое разделение;

— сорбционное разделение.

В качестве иллюстрации особенностей препаративного анализа рассмотрим типовую технологическую процедуру разделения исходно­го биосубстрата для определения содержания в пробе конкретного компонента — белка (рис. 2.1).

Процедура выделения белка начинается с проведения экстрак­ции— процесса извлечения при помощи растворителя отдельных ком­понентов сложной смеси. Последующие операции по выделению и очистке должны:

— обеспечивать быстрое отделение целевого компонента от сопут­ствующих примесей;

— обеспечивать высокую степень очистки;

— допускать обработку больших объемов жидкостей.

Набор методов, включенных в описываемую процедуру, обеспечи­вает эти требования для анализа большой группы биосубстратов.

Рис. 2.1. Типовая технологическая процедура разделения биосубстрата для определения содержания белка:

ГеХрГ – гельхроматография; ИОХрГ – ионнообменная хроматография; АфХрГ — аффинная хроматография; ЭФПААГ — электрофорез в полиакриламидном геле; ИЭФ — изоэлектрофокусирование; МФ — мембранная фильтрация; Д – диализ; ТСХрГ — тонкослойная хроматография; БХрГ— бумажная хроматография

Группа 4. Здесь можно выделить две подгруппы, как наиболее раз­витые в методическом отношении, — оптические методы и методы, основанные на эффектах ядерной физики.

Оптические методы измерения основаны на использовании раз­личных физико-химических явлений, возникающих при взаимодействии излучения оптического диапазона с веществом пробы: изменении ин­тенсивности, фазы, пространственной ориентации, спектрального со­става излучений и т. п. Нашли применение все три оптических диапа­зона электромагнитного излучения — ультрафиолетовый, видимый и инфракрасный.

Оптические методы широко используются в аналитических лабо­раториях. Анализаторы, с помощью которых реализуются оптиче­ские методы, вместе с электрохимическими анализаторами охваты­вают более 70 % всей лабораторной техники. Они могут быть ис­пользованы как для тончайшего микроанализа биологических ве­ществ, так и для измерения важных макропоказателей, характери­зующих свойства или концентрацию отдельных компонентов слож­ных биосубстратов. Оптические свойства разных компонентов поли­дисперсных гетерогенных сред отличаются, что позволяет судить об их наличии и концентрации путем регистрации параметров одного или нескольких световых потоков, прошедших исследуемую пробу или отраженных от нее; изучаются и собственные излучения био­пробы. При использовании специальных методов освещения иссле­дуемых сред, находящихся в жидкой фазе или с помощью методов подготовки высушенных отпечатков биожидкостей на стеклянных или пленочных подложках, можно восстановить пространственное распределение дисперсных фаз, а также оценить параметры отдель­ных фрагментов, твердых включений, пузырьков газа, клеток, мик­роорганизмов.

Большую подгруппу оптических методов составляют также мето­ды спектрального анализа, в которых для изучения состава биопро­бы и определения концентраций компонентов исследуются оптические спектры излучения и поглощения вещества. В спектральном анализе можно выделить как методически, так и по области применения: атомно-эмиссионный, в том числе и метод пламенной фотометрии; атомно-абсорбционный и атомно-флуоресцентный анализ. Данные методы отличаются необходимостью предварительного перевода ис­следуемой пробы в атомарное состояние.

Методы лабораторного анализа, основанные на эффектах ядер­ных взаимодействий, включают ряд методов (масс-спектрометрия, гамма-спектрометрия, рентгеноструктурные методы, электронная микроскопия и др.), позволяющих изучать тонкую структуру мно­гокомпонентных биопроб. Они основаны на взаимодействиях веще­ства с различного рода проникающими (волновыми и корпускуляр­ными) излучениями, эффекты которых проявляются на молекуляр­ном и атомарном уровнях. Эти методы получили достаточно огра­ниченное распространение в лабораторной практике в связи со сложностью методического и технического обеспечения и необхо­димостью соблюдения мер защиты обслуживающего персонала от проникающих излучений. Однако они интенсивно развиваются, со­вершенствуются и становятся все более доступными, чему способ­ствует появление новых медико-биологических и экологических за­дач, при решении которых подобные методы оказываются наиболее эффективными.

Рассмотренные методы пригодны для изучения биосубстратов как из ВС, так и из ОС. В то же время особенности задач, решаемых при исследовании биоматериалов из разных сред, отражаются на преиму­щественном выборе методов анализа.

Лекция №3

ТРЕБОВАНИЯ, ПРЕДЪЯВЛЯЕМЫЕ К МЕТОДАМ АНАЛИТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Требования, которые предъявляются к методам аналитических ис­следований, в первую очередь определяются биологической природой и свойствами объекта исследования.

Требования, ко­торые необходимо учитывать при выборе метода лабораторного анализа:

Для проб внутренней среды:

— возможность исследования при малых уровнях воз-действующих энергий и гарантии сохранения исследуемого вещества неповрежденным;

— обеспечение специфичности исследования, т. е. способности по­лучать показатели именно тех компонентов гетерогенной системы, ко­торые позволяют эффективно решить поставленную медико-биологи­ческую задачу;

— высокая чувствительность метода, т. е. получение существен­ных изменений выходных параметров сигналов при малых изменениях свойств биопробы;

— малые размеры активной зоны, т. е. минимизация объемов ана­лизируемых биопроб;

— минимально возможное время исследования, например за счет перехода к импульсным режимам работы

Для проб окружающей среды:

— возможность определения следов органических и неорга-нических веществ, находящихся в пробе на уровне долей 10^-9;

— достаточная селективность (специфичность);

— отсутствие сложной процедуры пробоподготовки;

— небольшая длительность выполнения исследования;

— возможность автоматизации методики (для проведения серий­ных анализов);

— независимость от уровня квалификации персонала;

— доступная стоимость оборудования;

— минимальные массогабаритные характеристики анализа-торов, позволяющие проводить исследование в полевых условиях;

— достаточная универсальность (определение большого количе­ства веществ, с одной стороны, и возможность одновременного опре­деления нескольких компонентов пробы — с другой.

Отмеченные требования определяют требования к измерительным преобразователям, например, такие, как их минимизация, высокая чув­ствительность, помехоустойчивость и др.

МЕТОДИЧЕСКИЕ СХЕМЫ ПРОВЕДЕНИЯ

АНАЛИТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Каждый из перечисленных выше методов предназначен для полу­чения информации о состоянии или свойствах изучаемого объекта. Чтобы такая информация стала доступной для исследователя, послед­нему необходимо организовать само исследование, т. е. предварительно подготовить оборудование и объект к эксперименту, а затем под­ключить технические средства таким образом, чтобы получить требуе­мый результат с минимальными искажениями. Определим схему вза­имного расположения объекта исследования и всех технических средств, необходимых для реализации выбранного метода лаборатор­ного эксперимента, как методическую схему его выполнения.

При выборе методической схемы основное внимание должно быть уделено качеству получаемой исследовательской информации. При этом качество информации определяется степенью ее достоверности, достигаемой в ходе эксперимента, особенно при наличии мешающих факторов, сопровождающих процесс исследования.

Биопроба из ИС представляет интерес только потому, что несет в себе информацию о состоянии и свойствах этой среды, вещест­венным носителем которой является тот или иной ее компонент. В то же время Биопроба содержит мешающие компоненты, которые при проведении измерений могут исказить параметр сигнала, несущий исследовательскую информацию. Это различные примеси, а также вещества, которые могут дать при применении выбранного метода такую же реакцию, как и полезная составляющая. Такие компонен­ты можно считать вещественными помехами. Тогда смысл всех преобразований, проводимых с биопробой, следует определить как выделение из нее полезной (релевантной) составляющей. Следовательно, в про­цедуру пробоподготовки аналитического этапа целесообразно вклю­чать те операции по преобразованию биопробы в конечный про­дукт, которые позволяют освободиться (по возможности) от ме­шающих компонентов, но при этом сохранить сведения о тех свой­ствах исследуемой среды, ради изучения которых и ставится меди­ко-биологический эксперимент.

Получение достоверных результатов предполагает учет следующих принципов адекватности:

— измеряемый физический параметр должен соответствовать ис­следуемой характеристике биопробы;

— все преобразования, входящие в пробоподготовку, должны из­менять БП таким образом, чтобы обеспечить соответствие физических параметров конечного продукта свойствам исходной биопробы.

Методические схемы многих методов по принципам своего по­строения совпадают, что позволяет во всем их многообразии выделить несколько типовых вариантов.

Одной из самых распространенных схем является внутреннее энер­гетическое (методическое) воздействие на биопробу, которое осуществляется в первичном измерительном преобразователе анализатора. В зависимости от характера энергетического воздействия будут прояв­ляться различные свойства пробы — каждое воздействие порождает ряд измерительных эффектов (см. подгл. 2.5). При этом доля энергии, измененная взаимодействием с веществом, преобразуется в электриче­ский сигнал, параметры которого несут информацию об исследуемых свойствах пробы.

Все методы, осно­ванные на эффектах взаимодействия пробы с потоком энергии, могут быть представлены общей методической схемой (рис.1 ).

Рис.1 Обобщенная методическая схема аналитического исследования

Пусть Е — поток энергии, подаваемой от специального источника (И) на измерительную кювету с КП_ИВ. Пренебрегая потерями энергии на пути к кювете, в материале кюветы и индифферентных веществах, можем утверждать, что в общем случае

,

где — доли потока энергии, соответственно поглощенная (запасенная), рассеянная (отраженная) биопробой и прошедшая сквозь биопробу.

Энергия, запасенная биопробой, при определенных условиях мо­жет быть излучена в виде потока энергии Е*₁ обычно имеющего иные характеристики, чем поток Е или Е₁. Поток энергии Е₃ может быть подвергнут воздействию со стороны вещества биопробы, при этом некоторые его параметры изменятся. Например, может изме­ниться направление потока излучения в соответствии с законами преломления на границе сред с различными показателями преломле­ния, направление плоскости поляризации и т. д. Такой поток энер­гии обозначен как Е*₃. Энергия Е₂ несет в себе информацию о пара­метрах взаимодействия пробы с падающим потоком Е. Та доля рас­сеянной энергии, которая подлежит измерению, обозначена как Е*_2.

Доля энергии, содержащая информацию о свойствах пробы, улавли­вается приемником первичного измерительного преобразователя, в котором характеристики потока энергии преобразуются в физические параметры, удобные для дальнейшего преобразования или непосредственного измерения.

Рассмотренная методическая схема пригодна практически для всех методов прямого измерения, применяемых в аналитических ис­следованиях. Под методами прямого измерения обычно понимают методы, основанные на измерении энергии, несущей информацию о непосредственном взаимодействии вещества с падающим потоком энергии. Свойством, зависящим от природы вещества, является, на­пример, длина волны спектральной линии в эмиссионной спектроско­пии, потенциал полуволны в полярографии, а количественной харак­теристикой служит интенсивность сигнала — интенсивность спек­тральной линии в первом случае и сила диффузионного тока — во втором. В некоторых методах (абсолютные методы) связь аналитического сигнала с природой вещества установлена мате­матически строго.

В методах косвенного измерения измерительная информация за­ключена в характеристиках дополнительно воздействующего на био­пробу агента (например, химического), а рассмотренное ранее энер­гетическое воздействие используется только для индикации характер­ного состояния биопробы. Типичный пример — методы титрования, в которых концентрация исследуемого компонента в биопробе опреде­ляется таким количеством вещества известной концентрации (титранта), вступающего в химическую реакцию с анализируемым вещест­вом, которое приводит пробу в характерное состояние (достижение точки эквивалентности), обнаруживаемое тем или иным способом. В ходе титрования измеряется интенсивность аналитического сигнала и строится кривая титрования, представляющая зависимость интен­сивности сигнала от объема добавленного в пробу титранта. Точка эквивалентности находится по кривой титрования. Виды кривых весьма многообразны, так как интенсивность аналитического сигнала может быть связана с концентрацией определяемого компонента, тит­ранта или продукта реакции.

Связь интенсивности аналитического сигнала I с концентрацией исследуемого компонента в прямых методах измерения имеет различ­ный характер. Часто эта зависимость выражается простым линейным соотношением:

I = АС, (2.5)

Где - некоторая константа; С — определяемая концентрация ком­понента.