А – обобщенная схема хроматографа; б – хорошо разрешенная хроматограмма четырехкомпонентной смеси

На рис. 4.2, б в качестве примера представлена хроматограмма, со­держащая информацию о разделяемой биопробе. Число пиков соответ­ствует исходному количеству компонентов; а по оси абсцисс отложе­ны величины времени «удерживания» каждого конкретного компонен­та внутри колонки, т. е. времени его эффективного выделения из об­щей смеси (t₁ — время удерживания для вещества, сорбирующегося наименее прочно).

Эффективность разделения пропорциональна длине колонки, но при увеличении ее длины происходит размывание зоны каждого ком­понента и, следовательно, расширение пиков (ширина пика пропор­циональна времени нахождения вещества в колонке), поэтому длину колонки необходимо ограничивать.

Описанный процесс отражает только самые общие черты хроматографического процесса, каждый вариант ХрГ имеет свои аппара­турные особенности, использует иные материалы для НФ и ПФ и требует различный режимов разделения. Поэтому для более деталь­ного ознакомления рассмотрим основные хроматографические мето­ды по отдельности.

АДСОРБЦИОННАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Адсорбционная хроматография основана на различной степени ад­сорбции компонентов исследуемой пробы на пористом адсорбенте. В зависимости от агрегатного состояния ПФ различают твердожидкост­ную адсорбционную ТЖАд или газоадсорбционную(Гад) ХрГ.

Пористые материалы обладают способностью достаточно прочно сорбировать различные вещества. В твердожидкостном варианте на границе твердой и жидкой фаз частицы твердого адсорбента обтекают­ся ПФ, несущей в растворенном виде анализируемую биопробу. Ее разделение происходит за счет того, что компоненты с различной прочностью удерживаются на поверхности адсорбента. При выполне­нии газоадсорбционного варианта растворитель заменяется на газ-но­ситель, который переносит по колонке газообразную смесь компонен­тов биопробы.

В качестве НФ в адсорбционной хроматографии используются не­сколько видов материалов.

Силикагелъ. Этот материал получают из золей кремневой кислоты, при этом в зависимости от условий проведения реакции образуются нерегулярные или сферические частицы различной величины и порис­тости. Хроматографию при нормальном давлении обычно проводят на сорбентах с размерами частиц 40...60 мкм, при высоком давлении — на сорбентах с размерами 3, 5, 7, 10 мкм. Важной характеристикой сорбента наряду с размерами частиц является средний диаметр их пор.

Силикагели применяются:

— для фракционирования неполярных и малополярных веществ;

— контроля качества разделения (главным образом, при высоком давлении на колонках с размером частиц 3... 15 мкм);

— препаративного фракционирования при нормальном дав-лении на сорбентах с размерами частиц 10...30 мкм;

— препаративного разделения в производственном масштабе на сорбентах с диаметрами частиц 60...200 и 200...500 мкм.

Оксид алюминия. Этот адсорбент характеризуется не только раз­мерами частиц, но и кислотно-оcновными свойствами: водная сус­пензия адсорбента может иметь кислую, нейтральную или основную реакцию. Кроме того, адсорбент может обладать различной степенью активности.

Оксид алюминия применяют для решения тех же задач, что и силикагель: на кислом оксиде алюминия разделяют вещества с кислот­ными свойствами (фенолы, карбоновые кислоты). На основном окси­де алюминия фракционируют основания (амины), а также удаляют перекиси, присутствующие в органических растворителях (эфире, диоксане и др.).

Поверхностно-модифицированный силикагель. К находящимся на поверхности частиц диоксида кремния атомам могут быть прикреп­лены различные группы (например, посредством ковалентной связи), полностью покрывающие поверхность силикагеля, вследствие чего по­лярный сорбент приобретает гидрофобные свойства. Наиболее прочная адсорбция неполярных и умеренно полярных соединений наблюдается в водной среде. Десорбция происходит в присутствии органических растворителей. Поверхностно-модифицированные силикагели приме­няют, в основном, в хроматографии с обращенными фазами для аналитического и полупрепаративного разделения, главным образом, полярных веществ.

КОЛОНОЧНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Метод колоночной жидкостной хроматографии (КлЖХрГ) впер­вые был предложен в 1906 г. как метод разделения смеси веществ, по­зволяющий осуществлять эту операцию как на микроуровне, так и при решении препаративных задач.

Неподвижную фазу помещают в колонку, затем вносят в нее ана­лизируемую смесь (биопробу) и элюируют соответствующим раство­рителем (ПФ). При продвижении по колонке компоненты смеси по-разному удерживаются сорбентом в зависимости от своих физи­ко-химических свойств и, следовательно, перемещаются с разной ско­ростью. На выходе колонки разделяемые вещества появляются в опре­деленной последовательности и могут быть собраны в виде отдельных фракций.

В (КлЖХрГ) конечный результат зависит не только от того, на­сколько принцип разделения (адсорбция, распределение, ионообмен или гель-хроматография) соответствует свойствам анализируемых ве­ществ, но и от множества других факторов:

— свойств системы сорбент-элюент;

— условий элюирования (скорость потока, температура, вяз-кость элюента);

— конструкции и размеров колонки;

— нагрузки колонки (количество пробы);

— качества упаковки колонки;

— размеров частиц, среднего диаметра пор частиц сорбента;

— конструкции основных элементов хроматографической сис-темы (блок ввода пробы, мертвый объем в соединительных шлангах и ячей­ке детектора);

—качества подготовки пробы.

Качество разделения (эффективность работы колонки) зависит так­же от равномерности ее упаковки и от скорости установления равнове­сия между актами адсорбции — десорбции вещества.

Основное преимущество (КлЖХрГ) перед газовой состоит в возмож­ности разделения веществ при более низких температурах (в диапазо­не от температуры замерзания до кипения растворителя), поэтому этот метод позволяет разделять термически неустойчивые вещества (напри­мер, белки), которые нельзя испарить без разрушения.

ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ НИЗКОГО ДАВЛЕНИЯ

В жидкостной хроматографии низкого давления компоненты смеси разделяют в хроматографической колонке при нормальном (гидроста­тическом) или несколько повышенном давлении. С помощью этого ва­рианта можно разделять разнообразные вещества — от низкомолеку­лярных соединений до сложных биополимеров и их комплексов.

Факторами, обеспечивающими оптимальное разрешение, являются: небольшие размеры частиц сорбента и их возможно более узкий фрак­ционный состав, небольшая скорость подачи элюента и малая вязкость элюента (вследствие чего быстро устанавливается диффузионное рав­новесие), возможно более высокая температура.

Обычно разделение на мягких сорбентах (сефадексы, биогели, гели агарозы и полистирольные гели) проводят при атмосферном дав­лении. Этот вид хроматографии применяют для переработки больших объемов жидкости, когда не ставится задача достижения высокого раз­решения и нет ограничений по продолжительности эксперимента. Если скорость подачи ПФ достаточно высока, то частицы сорбента должны иметь сравнительно крупные размеры. В аналитических лабораториях колончатую (ЖХрГ) низкого давления проводят на сорбентах с диамет­ром частиц 40...60 мкм, в производственных условиях — с диаметром 100...200 мкм и более.

Коротко опишем основную аппаратуру, необходимую для прове­дения данного типа (ЖХрГ).

Хроматографическая система (рис. 4.4.) включает: резервуар или градиентный смеситель для размещения ПФ, насос для подачи ПФ, устройство ввода пробы, колонку, детектор для обнаружения компо­нентов пробы в элюате, самописец, автоматизированный коллектор для сбора фракций.

Устройства ввода пробы. Непосредственное внесение биопробы осуществляется при помощи пипетки или тефлонового капилляра, конец которого (длиной ≈ 3 мм) изогнут под углом 90°. Биопробу с высоким удельным весом помещают под слой растворителя на столбик сорбента при помощи специального адаптера—поршня, который ограничивает высоту слоя сорбента в колонке. Большие объемы жидкости подают на колонку из резервуаров через систему специальных кранов. Иногда био­пробу вносят при помощи дозирующей петли, которую при нормальном давлении заполняют раствором биопробы, после чего переносят ее в ко­лонку. Этот способ применяют при внесении небольших объемов. Био­пробу предварительно фильтруют или центрифугируют для того, чтобы отделить коллоидные частицы и механические примеси.

Рис. 4.4. Общая схема хроматографической установки для ЖХрГ низкого давления: