Визначення активностей ферментів та концентрації білка

2.3.1. Приготування супернатанту

Відібрані зразки тканин риб гомогенізували (1:10, m:V) за допомогою гомогенізатора Поттера в середовищі, яке містило (тут і надалі наведено кінцеві концентрації): 50 мМ калій-фосфатний буфер (КФБ; рН 7,0) і 0,5 мМ етилендиамінтетраацетат (ЕДТА) та 1 мМ фенілметилсульфонілфторид (ФМСФ). Отримані гомогенати центрифугували 15 хв при температурі 4 ^oС і 13200 g на центрифузі Eppendorf 5415R (Німеччина). Осад відкидали, а у супернатантах визначали активність ферментів та концентрацію білка.

2.3.2. Визначення активності каталази

Каталазну активність визначали на спектрофотометрі СФ-46 (Ломо, СРСР), реєструючи зміну оптичного поглинання пероксиду водню при довжині хвилі 240 нм [Aebi] у пробі об’ємом 2 мл, що містила 50 мМ КФБ (рН 7,0), 0,5 мМ ЕДТА, 10 мМ Н₂О₂ та 20 мкл супернатанту. Для розрахунків використовували коефіцієнт молярної екстинції Н₂О₂ 39,4 М^-1см^-1 [Aebi].

Активність каталази розраховували за наступною формулою:

,

де А – активність каталази, Од/мг білка;

ΔОD_хв– зміна оптичного поглинання за 1 хв;

V_пр – об’єм проби, мл;

ε– коефіцієнт молярної екстинції;

V_суп – об’єм супернатанту, мл;

[білок] – концентрація білка в супернатанті (мг/мл).

За одну одиницю активності каталази приймали таку кількість ферменту, яка перетворює 1 мкмоль пероксиду водню за 1 хвилину за вказаних умов. Питому активність каталази виражали в одиницях (Од) та нормували на міліграм загального білка супернатанту (Од/мг білка).

2.3.2. Визначення активності супероксиддисмутази

Активність супероксиддисмутази (СОД)визначали за ступенем інгібування реакції окиснення кверцетину супероксид-аніоном, який генерували у системі з ТЕМЕД (N,N,N′,N′-тетраметилетилендіамін)-тріс-HCl (рН 10,0) при 406 нм на спектрофотометрі „Spekol 211” (Німеччина) [Lushchak 2005]. Середовище для визначення активності СОД містило 30 мМ трис буфер (рН 10,0), 0,5 мМ ЕДТА, 0,8 мМ ТЕМЕД (N,N,N′,N′-тетраметилетилендіамін), 0,05 мМ кверцетин та різні об’єми супернатанту. Реакцію починали послідовним внесенням супернатанту та кверцетину, проте в “нульову” пробу супернатант не додавався. Швидкість реакції (зміну оптичного поглинання за хвилину, ОD/хв) визначали при 5–7 різних об’ємах препарату для досягнення різного ступеня інгібування реакції. За умовну одиницю (Од) активності СОД приймали таку кількість препарату, яка інгібувала реакцію окиснення кверцетину наполовину від максимальної. Даний показник (К₅₀) розраховували за допомогою комп’ютерної програми KINETICS, версія 3.1 [Brooks].

Активність ферменту визначали за формулою:

де A_СОД – активність СОД, Од/мг білка;

К₅₀ – константа половинного інгібування реакції окиснення кверцетину;

[білок] – концентрація білка у супернатанті, мг/мл.

2.2.3Визначення концентрації білка

Концентрацію білка визначали за методом Бредфорд [Bradford], який ґрунтується на здатності білків зв’язуватися з барвником Кумасі яскраво-голубим G-250 та утворювати забарвлені сполуки. До 1 мл зразка, який містив не більше 20 мкг білка, додавали 1 мл 0,005% розчину барвника Кумасі яскраво-голубого G-250 в 3% HClO₄. Оптичне поглинання комплексу реєстрували при довжині хвилі 595 нм на спектрофотометрі Spekol 211 (Carl Zeiss, Німеччина) після 15 хв інкубації проб при кімнатній температурі. Концентрацію білка (мг/мл) в досліджуваних пробах визначали за допомогою рівняння лінійної регресії, отриманого на основі калібрувального графіку, побудованого зі стандартного розчину білка з концентраціями 0-16 мкг/мл. Як стандарт використовували бичачий сироватковий альбумін.

Статистична обробка даних

Експерименти проводили у двох біологічних повторах. Статистичну обробку результатів проводили, використовуючи програму MYNOVA (версія 1.3). В якості статистичних показників брали середнє арифметичне (М) та похибку середнього арифметичного S (m). Порівняння середніх арифметичних і визначення достовірної різниці між ними проводили за допомогою критерію Даннета. Значення Р<0,05 розглядали як критерій достовірної різниці порівняно з контрольними значеннями.